03

Materiał: Trzustka lub inna tkanka bogata w RNA.

Odczynniki:

1)    Bufor denaturujący o pH 7,0: 4 M izotiocyjanian guanidyny - 25 mM cytrynian sodowy - 0,5% sarkozyl -0,1 M 2-merkaptoetanol.

2)    2 M roztwór CH₃COONa (pH 4,0).

3)    Fenol nasycony o pH 7,8-8,0.

4)    Mieszanina: chloroform/alkohol izoamylowy (obj. 49:1).

5)    lzopropanol.

6)    75% roztwór etanolu.

7)    0,5% roztwór SDS.

Ważniejsze przyrządy: Homogenizator tłokowy szklano-teflonowy, łaźnia wodna o zakresie temperatur obejmującym 65°C.

Wykonanie:

1.    Świeżą tkankę natychmiast po pobraniu umieścić w lodzie, rozdrobnić i homogenizować w homogenizatorze szklanym z teflonowym tłokiem. W przypadku tkanki mrożonej można ją rozmrozić i postępować jak wyżej, bądź też rozdrobnić ją w stanie zamrożenia i zemleć w homogenizatorze nożowym. Przenieść rozdrobnioną tkankę do probówki homogenizatora tłokowego i dodać 1 ml roztworu denaturującego (odcz. 1). Homogenizować.

2.    Przenieść homogenat do probówki polipropylenowej o pojemności 4 ml. Dodawać kolejno: 0,1 ml odcz. 2), 1 ml odcz. 3), 0,2 ml odcz. 4), po każdym dodaniu mieszając przez odwracanie. Po wprowadzeniu ostatniego odczynnika wytrząsać energicznie przez 10 s i pozostawić na lodzie przez 15 min.

3.    Odwirować (10000 x g w temp. 4°C przez 20 min), po czym RNA powinien być w fazie wodnej, natomiast DNA i białka będą znajdować się w interfazie i fazie organicznej.

4.    Przenieść fazę wodną do nowej probówki, zmieszać z 1 ml izopropanolu (odcz. 5), umieścić w temp. — 20°C przez co najmniej 1 godz. w celu wytrącenia DNA. Odwirować (10000 x g w temp. 4°C przez 20 min). Usunąć supernatant.

5.    Rozpuścić osad w 0,3 ml buforu denaturującego (odcz. 1). Zawiesinę przenieść do probówki o pojemności 1,5 ml i wytrącać RNA 1 objętością izopropanolu w temp. - 20°C przez 1 godz.

6.    Odwirować (12000 xg w temp. 4°C przez 10 min). Osad rozpuścić w 75% etanolu (odcz. 6).

7.    Odwirować (12000xg w temp. 4°C przez 10 min). Usunąć supernatant. Osad suszyć pod obniżonym ciśnieniem przez 15 min.

8.    Rozpuszczać osad w 50 pl 0,5% roztworu SDS (odcz. 7) w temp. 65°C przez 10 min. Uwagi:

1)    Zamiast chloroformu można stosować mniej toksyczny bromochloropropan (Chomczynski i Mackey 1995).

2)    Cząsteczki RNA można rozpuszczać w H₂0 lub 1 mM roztworze EDTA (pH 8,0), lecz użycie 0,5% roztworu SDS, który jest inhibitorem RNaz, może częściowo zabezpieczać przed degradacją na skutek zanieczyszczenia rybonukleazami.

3)    Wydajność tej metody wynosi ok. 1,8 pg RNA/mg tkanki.

4)    Stosunek A₂₆₀/A₂₈₀ RNA otrzymanego tą metodą wynosi ok. 1,9, a DNA nie powinien być wykrywalny metodami kolorymetrycznymi.

383