00 2

Na głębokość wgięcia anodowego wpływają w pewnym stopniu zanieczyszczenia, najczęściej spotykane w preparatach DNA, np. 5% roztwór histonu zmniejsza wgięcie o 10%, a RNA zwiększa je z kolei o 10%.

Wartość masy cząsteczkowej DNA wpływa na wielkość wgięcia; np. po działaniu ultradźwięków, gdy następuje degradacja powodująca zmniejszenie się lepkości, wgięcie anodowe pogłębia się o 20%. Cząsteczki poli(C), poli(A) i poli(U) nie wytwarzają wgięcia anodowego, a z drugiej strony pojawia się ono na oscylopolaro-gramach RNA i poli(UG), co potwierdza tezę, że zmiany anodowe natywnego DNA na krzywej dE/di = f(E) są powodowane przez reszty kwasu deoksyguanylowego, które uwalniają się z podwójnego heliksu na powierzchni elektrody rtęciowej, w powtarzających się okresach prądu polaryzującego.

Głębokość wgięcia anodowego natywnego DNA zależy od jego pochodzenia i nie jest wprost proporcjonalna do zawartości guaniny w cząsteczce (rys. 10.8). Po denaturacji głębokość wgięcia wzrasta i wykazuje korelację z ilością par GC.

Zmiany katodowe wytwarzane przez kwas deoksyrybonukleinowy na krzywej oscylo-polarograficznej dE;dt = f{E). W środowisku mrówczanu amonu o pH 7 zdenaturo-wany DNA ulega polarograficznej redukcji. W badaniach oscylopolarograficznych redukcja ta uwidacznia się powstawaniem charakterystycznego wgięcia w katodowej części oscylogramów. Zgodnie z omówionymi badaniami oscylopolarograficznego zachowania się cytozyny, zmiany w katodowej części krzywej dE/dt = f(E) są związane z obecnością tej zasady w łańcuchu polinukleotydowym DNA. Wgięcie krzywej, podobnie jak dla DNA, występuje na oscylopolarogramach kwasu apury-nowego i RNA, nie jest natomiast wytwarzane przez produkty degradacji DNA pozbawione cytozyny. Natywny DNA nie jest redukowany w tych warunkach i pojawienie się wgięcia katodowego na oscylopolarogramach jest wyraźną wskazówką denaturacji, mogącą posłużyć do badania przebiegu tego procesu albo też do pomiarów' zawartości zdenaturowanego DNA w danej próbce kwasu, nawet wobec dużych ilości natywmego DNA.

Należy podkreślić, że obserw-acje dotyczące redukcji DNA na elektrodzie rtęciowej potwierdzono badaniami syntetycznych polinukleotydów.

Głębokość wgięcia katodowego zdenaturowanego DNA wykazuje — podobnie jak w części anodowej korelację w stosunku do zawartości par G C, o ile doświadczenie przeprowadza się w wysokiej temperaturze, zapobiegającej ponownemu złączeniu się przez agregację rozerwanych labilnych wiązań. Zależność taką przedstawiono na rys. 10.9.

Zastosowanie metody oscylopolarograflcznej do badania T_m. Stwierdzono, że w czasie stopniowej denaturacji DNA występują zmiany w wielkości wgięcia anodowego i katodowego pozwalające wykreślić zależność podobną, jak przy spektrofotomcl-rycznych oznaczeniach T_m. Porównując denaturację termiczną oznaczoną oscylo-polarograficznie i spcktrofotometrycznie należy uwzględnić, że pierwsze zmiany, które można ocenić jako przeddenaturacyjne, zauważa się znacznie szybciej z użyciem metody oscylopolarograflcznej. Pierwsze zauważalne zmiany wgięcia krzywej

410