00

5)    Postępowanie w etapie 6. prowadzi do wybiórczego wytrącenia makromolcku! kwasów nukleinowych, i tym samym do ich oddzielenia od związków małocząstecz-kowych oraz aminokwasów i krótkich peptydów powstałych w procesie trawienia białek pronazą. Wielkie cząsteczki kwasów nukleinowych ulegają wytrąceniu w środowisku 70% roztworu etanolu, a obecny w środowisku CH₃COONH₄ (w odpowiednim stężeniu) dodatkowo wzmaga ten proces. W przypadku, gdy osad kwasów nukleinowych jest kłaczkowaty i nie tworzy większych, nitkowatych agregatów, wyławianie bagietką podczas etapu wytrącania i przepłukiwania należy zastąpić przez wirowanie i dekantowanie supernatantu. Taka postać osadu jest jednocześnie dowodem daleko posuniętej degradacji wielkocząsteczek DNA, co świadczyć może o uchybieniach popełnionych w trakcie poprzednich etapów procedury.

6)    Podgrzewanie preparatu DNA do temp. 95°C (etap 7.) powoduje denaturacie dwuniciowych fragmentów DNA do pojedynczych nici i jest konieczne do efektywnej hydrolizy DNA w kolejnym etapie.

7)    Nuklcaza PI z grzyba Peniciliium citrinum stosowana w etapie 8. jest enzymem hydrolizującym wiązania fosfodiestrowe łączące nukleozydy w łańcuchach kwasów nukleinowych. Trawi ona zarówno RN A, jak i DNA, ten ostatni jednak znacznie łatwiej, gdy występuje on w postaci jednoniciowej. Produktem hydrolizy katalizowanej przez ten enzym są wolne nukleotydy, a ściślej 3'-monofosfonukleozydy. Nuklcaza PI osiąga maksimum aktywności w' pH 4,8, stąd też przed dodaniem enzymu traktuje się preparat buforem octanowym o takim właśnie pH (odcz. 9). Bufor ten zawiera rówmież jony cynku, ponieważ aktywność nukleazy PI jest zależna od obecności tych jonów.

8)    Fosfataza zasadowa izolowana z bakterii Escherichia coli jest fosfohydrolazą zdolną do odcinania grup fosforowych w wolnych nukleotydach, degradując je do nuklcozydów. Słow-o „zasadowa” zwraca uwagę na to, iż enzym ten osiąga największą aktywność w pH powyżej 7, dlatego przed rozpoczęciem etapu 9., tj. hydrolizy, należy zmienić pH preparatu z kwasowego na zasadowe, poprzez dodanie stężonego buforu Tris/HCl (pH 7,5; odcz. 11).

9)    Roztwory nanoszone na kolumnę HPLC (etap 10.) muszą być uprzednio pozbawione wszelkich zanieczyszczeń stałych (kurz, osady), które mogłyby doprowadzić do jej zapchania. Najłatwiejszym sposobem uniknięcia tego niebezpieczeństwa jest odwirowanie analizowanego roztworu. Najczęściej jednak próbki przefiltrowuje się za pomocą filtrów o średnicy porów 0,2 pm. Rozwiązaniem idealnym jest przefiltrowanie hydrolizatu DNA przez ultrasączek o odcięciu 30 kDa (np. Ultra-free-MC firmy Millipore, USA). Zatrzymuje on makromolekuły o m.cz. ponad 30 kDa. Pozwala to odłączyć enzymy użyte do hydrolizy DNA od preparatu nuklcozydów'.

Można również przeprowadzić prostsze ćwiczenie zapoznające z techniką HPLC, obejmujące 1 dzień ćwiczeniowy i polegające na oznaczeniu stężenia 2'-deoksycytydyny w mieszaninie z 2'-deoksyguanozyną, 2'-deoksytymidyną. 2'-de-oksyadenozyną lub innego dowolnego nukleozydu. W tym celu należy przygotować eluent i roztwory wzorcowe 2'-deoksycytydyny zgodnie z procedurą opisaną wyżej oraz roztwór 4 wymienionych nukleozydów o stężeniu ok. 0,1 mg/ml. Następnie

430