20080505073

2) Sprawdzić, jakie miejsca rozpoznają enzymy restrykcyjne Sspl i Mbol w intcmecie.

Dzień II

3) Elektroforeza w żelu agarozowym.

a.    Przygotować 1 % żel agarozowym agarozowym buforze IAE (1 x stęż).

b.    Przygotować próbki do nałożenia na żel: po 10 pi produktu PCR i 2.5 pl bu oru obciążającego.

c.    Nałożyć tak przygotowane próbki na żel.

d.    Prowadzić elektroforezę przy 90 V przez 30 minut, c. Żel barwić w bromku ctydyny przez 10 minut.

4) Przygotować reakcję mctyiacji.

Bufor reakcyjny dam methylasc S-adenozylometionina Metylaza dam Produkt PCR - 15 pl Woda - uzupełnić do 20 pl

Stężenie wyjściowe 10x

3.2mM

8000U/ml

łC‘CO - U

Z

Stężenie końcowe lx J/*/ 80 pM

2U/r

o

o

U

Inkubacja w 37°C przez 1 h. Inaktywacja w 65°C przez 15 minut.

5) Przygotować reakcje trawienia produktu PCR enzymami restrykcyjnymi:

V wrH

a)    Sspl

Stężenie wyjściowe Bufor G    10x

Sspl    lU/pI

Produkt PCR - 10 pl Woda — uzupełnić do 15 pl

b)    Mbol

Stężenie wyjściowe

Bufor R    10x

Mbol    lU/pl

Produkt PCR-lOpI Woda - uzupełnić do 15 pl

Stężenie końcowe 1 x

2U/r

Stężenie końcowe lx

2U/r

c) Sspl + Mbol

Stężenie wyjściowe

Bufor Tango ™

Sspl

Mbol

Produkt PCR - 10 pl Woda - uzupełnić do

10x

lU/pl

lU/pl

15 pl

Stężenie końcowe lx

2U/r

2U/r

Inkubacja w 37°C przez 2 h.