CCF20081011019

B. Oznaczanie aktywności hydrolaz w materiale biologicznym.

Do klasy hydrolaz zalicza się enzymy katalizujące proces rozpadu substratu z udziałem wody. Enzymy te nie wymagają do aktywności katalitycznej współdziałania koenzymów, a ich nazwy systematyczne tworzy się dodając do terminu hydrolaza nazwę substratu, np. hydrolaza acetylo-CoA. Nazwy potoczne mają przeważnie końcówkę -aza dodaną do nazwy substratu, np. ureaza, lub też są to nazwy zwyczajowe, np. pepsyna, trypsyna, papaina. Ze względu na rodzaj hydrol i zowanego wiązania w klasie hydrolaz można wyróżnić następujące ważniejsze podklasy enzymów: esterazy (3.1), glikozydazy (3.2), peptydazy (3.4), amidazy (3.5) oraz hydrolazy bezwodników kwasowych (3.6).

1) Enzymatyczna hydroliza tłuszczu mleka

Lipazy są esterazami katalizującymi hydrolizę tłuszczów do glicerolu i kwasów tłuszczowych według schematu:

R,-0-C0-R₂ + H₂0 -> R,-OH + R₂-COOH

Lipazy wykazują niewielką specyficzność i katalizują rozkład estrów, utworzonych przez kwasy o krótkim i długim łańcuchu, nasycone i nienasycone, oraz alkohole mające łańcuch krótki lub długi, jedno- lub wielowodorotlenowe. Lipazy' występują w dużym stężeniu m.in. w soku trzustkowym, a ich aktywność wzmagają kwasy żółciowe, które ułatwiają emulgowanie tłuszczu.

Wykonanie: Do 5 cm^J mleka dodać 5 kropli 1% roztworu fenoloftaleiny i parę kropli 1% roztworu węglanu sodu do lekko różowego zabarwienia. Do tak przygotowanego roztworu dodać skrawek trzustki świni dokładnie utarty w moździerzu. Probówkę wstawić do łaźni wodnej o temp. 40°C. Obserwować zmianę zabarwienia.

2) Wykrywanie amylazy trzustki

Wszystkie amylazy należą do klasy hydrolaz i podklasy glikozydaz. Amylaza trzustkowa wykazuje wyższą aktywność od amylazy ślinowej. Enzym ten działa jeszcze w rozcieńczeniu 1: 100 000 000, a w ciągu 30 min 1 mg amylazy trawi 20 g skrobi. Do tej aktywności niezbędne są niektóre jony nieorganiczne, szczególnie chlorki. Amylaza trzustkowa, w odróżnieniu od ślinowej, hydrolizuje skrobię niegotowaną.

Wykonanie: do 3 cm^J 1% roztworu skrobi dodać kroplę 0,2% roztworu jodu w KI, parę kropli 1% roztworu NaCl i około 1 g zmielonej trzustki. Wstawić do łaźni wodnej o temp. 40°C. Obserwować odbarwienie się zawartości probówki będące wynikiem postępującej hydrolizy skrobi.

2006

5