img079

przechodzą do przesączu. Stosunkowo najlops/r warunki rozdziału uzyskuje się, dobierając laki adsorbent i rozpuszczalnik, aby adsorpcja w danym układzie nie była zbyt silna.

Klasyczna metoda ( wicia polegała na rozdziale barwników roślinnych w drodze filtracji ich roztworu pr/c/ kolumnę sproszkowanego adsorbentu umieszczonego w rurce szklanej (1x18 cm), zwężonej na jednym końcu i umieszczonej w kolbie ssawkowej połączonej z pompą próżniową (rys. 4.2). Kolumnę chromatograficzną stanowią ułożone jedna na drugiej warstwy adsorbentu, których polarność maleje w minię przesuwania się ku wierzchołkowi kolumny, a więc A1₂0₃ (ok. 2 cm), CaC0₃ (ok. 4 cm) i sacharc (ok. 6 cm), przykryta watą. Kolumnę nasyca się odpowiednim rozpuszczalnikiem (eter naftowy), a na wierzchołek kolumny nanosi się mieszaninę barwników polarnych rozpuszczonych w eterze nafto\ które zostają zaadsorbowanc z różną siłą. Z uwagi na powinowactwo adsorpcyjne, grupy funkcyj barwników roślinnych stanowią następujący szereg: karboksylowe > alkoholowe > ketonowe.

Rys. 4.2. Rozdział barwników roślinnych na kolumnie chromatografie/ nej (wg: Filipowicz i Więckowski 1973: Biochemia, t. 1. PWN. War szawa. s. 43).

Przepływ przez kolumnę niepolarnego solwentu (eter naftowy lub mieszanina eter naftowy/benzen 9:1) / zastosowaniem podciśnienia w kolbie ssawkowej powoduje rozdział barwników roślinnych na barwne pasma. Najwyższe jest utworzone przez najsilniej zaadsorbowany żółtozielony chlorofil b (2 grupy COOM i 1 grupa —CHO), a niższe — przez, niebieskoziclony chlorofil a (bez grupy —CHO), żółty luteinol (2 grupy —OH) i pozbawione grup funkcyjnych pomarańczowe karoteny (w Al₂0,). wśród których zdolności adsorpcyjne wzrastają wraz. z ilością podwójnych wiązań, np. likopen (13 podwójnych wiązań) jest adsorbowany silniej niż y-karoten (12). a ten ostatni silniej niż /ł-karoten (11 wiązań podwójnych).

Metoda kolumnowej chromatografii adsorpcyjnej znajduje zastosowanie głównie do badania karotenoidów, steroidów, porfiryn, barwników żółciowych, pteryn itp. Szczególnie pomyślny jest rozdział związków o niewielkich masach cząsteczkowych.

Ćwiczenie 4.1. Jakościowy rozdział barwników roślinnych w drodze chromatografii udsorpcyjnej

(hic/.'.yiiniki:

1)    Skrobia rozpuszczalna.

2)    Eter naftowy.

3)    Mieszanina: eter naftowy/etanol (98:10).

4)    Mieszanina: eter naftowy/etanol/etcr etylowy (93:2:5).

Wykonanie:

1.    Przygotowanie kolumny. Do rurki szklanej wprowadzić małymi porcjami skrobię, lekko ją ubijając przez potrząsanie rurką (wysokość kolumny skrobiowej ok. 15 cm). Na górnej powierzchni skrobi umieścić mały kłębek waty. Po ściance rurki wlać ostrożnie małymi porcjami 10 ml eteru naftowego, przestrzegając, aby nie wzburzyć górnej powierzchni skrobi i aby warstwa cieczy nad skrobią stale wynosiła ok. 0.5 cm. Przemywanie kolumny zostaje ukończone z chwilą, gdy nadmiar rozpuszczalnika zacznie wypływać z dołu kolumny. Nad górną powierzchnią skrobi musi pozostawać stale warstwa ok. 0,5 cm rozpuszczalnika.

2.    Przygotowanie wyciągu z liści. 2 g liści pokrzywy utrzeć z piaskiem w moździerzu porcelanowym. Dodać ok. 10 ml mieszaniny eteru naftowego z etanolem i przesączyć przez bibułę zwilżoną eterem naftowym do suchej i czystej probówki.

J. Rozwijanie chromatogramu. Przesączony ekstrakt z liści wprowadzić na kolumnę; gdy cały wyciąg (również z górnej części 0,5-ccntymetrowej warstwy) zaadsorbuje się na skrobi, dodać powoli małymi porcjami ok. 15 ml rozpuszczalnika złożonego z mieszaniny eteru naftowego, etanolu i eteru etylowego. Obserwuje się wyraźny rozdział barwników liści według następującej kolejności: żółtozielony chlorofil b (podrozdz. 11.7), który najsilniej adsorbuje się na skrobi, pozostaje w górnej części kolumny, pod nim — niebieskozielona warstwa chlorofilu a, zaś żółty ksantofil zajmuje położenie najniższe.

4.3. CHROMATOGRAFIA JONOWYMIENNA 4.3.1. Charakterystyka procesu wymiany jonów

C hromatografia jonowymienna polega na wymianie wszystkich zdolnych do wymia-ny jonów (dodatnich i ujemnych) sorbentu (jonitu), na inne jony o tvm samym ładunku, zawarte w roztworze.

Jonity są to ciała stałe nierozpuszczalne w^r wodzie oraz w najczęściej stosowanych rozpuszczalnikach organicznych, które mają właściwość wymiany jonów związanych z substancją wymieniacza na jony w roztworze. Są to z reguły substancje wielkocząsteczkowe, w których wyodrębnia się matrycę w postaci gąbczastej sieci przestrzennej oraz grupy chemicznie czynne (grupy funkcyjne) kwasowe lub zasadowe, zawsze zajęte przez jony o znaku przeciwnym. Rodzaj grup funkcyjnych decyduje o charakterze reakcji wymiany.

103