img101 2

abłorbancji na stężenie rozdzielanych substancji, posługując się odpowiednimi krzywymi kalibracyjnymi. Z uzyskanych wartości wykonać wykres zależności stęż ma|w mg) od objętości elucyjncj V_e (w ml). Obliczyć wartości K_#v dla cytochromu i KjCr0₄. Wyniki wpisać do zestawienia:

Składnik	V0 (ml)	K (ml)	K-K	K-vjv,-Vo
Cytochrom <• KjCr04

Ćwiczenie 4.18. Zastosowanie techniki cienkowarstwowej filtracji żelowej do oznu czinia masy cząsteczkowej białek (Course in Gel Filtration. Pharmacia Fine Chemi cali, Uppsala 1970)

Mikrial: Białko jaja kurzego rozcieńczone 0.9% roztworem NaCl (1:5).

Oknnoiki:

1)    Roztwory białek o wzorcowych masach cząsteczkowych w 0.9% NaCI:

a)    hemoglobina (m.cz. 64 000). 20 mg/ml,

b)    cytochrom c (m.cz. 13 000), 20 mg/ml,

c)    albumina bydlęca (m.cz. 67 000), 20 mg/ml,

d)    y-globulina bydlęca (m.cz. 160 000), 20 mg/ml.

2)    0.9% roztwór NaCl.

3)    0,1% roztwór błękitu bromofcnolowego w mieszaninie: CHjCOOH lodowaty/mctanol (1:9).

4)    5% roztwór CH₃COOH.

5)    Sephadcx G-150 Supcrfine (3 g, napęczniały w H₂0).

6)    Bibuła Whatman nr 3MM.

llttjsa: Zamiast albuminy i y-globuliny można zastosować surowicę bydlęcą rozcieńczoną 0,9% roztworem NaCl (1:2).

Wykonanie: Zdckantować wodę znad napęczniałego żelu. Na starannie wymytej, odtłuszczonej i suchej płytce szklanej uformować warstwę żelu o grubości ok. 0,5 1,0 mm rozprowadzając żel za pomocą bagietki, na końcach której nawinięto warstwę taśmy klejącej o grubości 0,5-1,0 mm (grubość taśmy 0,1 mm). Płytkę natychmiast umieścić w komorze ze szkła organicznego i warstwę żelu połączyć /.i pomocą pasków bibuły Whatman nr 3MM z roztworami 0,9% NaCl, wlanymi do pojemników komory (w górnym 50 ml, w dolnym — 25 ml) (rys. 4.19). Komorę nakryć pokrywą, a taśmą klejącą zakleić znajdującą się w niej szczelinę, służącą do nanoszenia próbek na żel. Odległość szczeliny (linii startu) od krawędzi płytki wynosi 4 cm. Komorę ustawić pod kątem 15° i pozostawić na 10-12 godz. w celu zrównoważenia. Następnie ustawić komorę w pozycji poziomej, usunąć taśmę klejącą ze szczeliny i nałożyć na linii startu, w równych odstępach, po 5 pl roztworów białek (wymienionych w spisie odczynników) w następującej kolejności la, Ib, białko jaja, lc, ld, Ib, białko jaja, la, ld i lc. Do górnego pojemnika dodać 25ml 0,9% roztworu NaCl, ponownie zakleić szczelinę w pokrywie, komorę ustawić pod kątem 20 i prowadzić rozdział w ciągu ok. 6 godz. Ustawić komorę w pozycji poziomej, ostrą bagietką zaznaczyć linię startu, zdjąć pokrywę i usunąć łączniki z bibuły. Na żel nałożyć, poczynając od linii startu, arkusz bibuły Whatman ni 3MM o rozmiarach płytki. Po upływie 1 min zdjąć ostrożnie bibułę (replikę)

Kys. 4.19. Schemat komory do cienkowarstwowej filtracji żelowej. 1 — komora ze %/kła organicznego, 2 — płytka szklana 20x40 cm, 3 warstwa żelu, 4 linia Hartu, 5 łączniki z bibuły, 6 — pojemniki z 0,9% roztworem NaCl, 7 — pokrywa, 8 szczelina do nanoszenia próbek

z żelu, umieścić ją na okres 1 min w roztworze błękitu bromofcnolowego, a następnie przenieść do 5% roztworu CH₃COOH i płukać aż do odbarwienia tła. Zmierzyć w cm drogę D, jaką przebyły poszczególne białka. Sporządzić wykres zależności /) od log m.cz. białek wzorcowych. Z wykresu odczytać wartość masy cząsteczkowej owoalbuminy, głównego składnika białka jaja.

Ćwiczenie 6.19. Frakcjonowanie glikozaminoglikuronoglikanów na jonowymieniaczu l)EAE-Scphadex (patrz ćw. 7.60)

Ćwiczenie 6.20. Rozdział kompleksów proteoglikanowych na podjednostki za pomocą filtracji na żelu Sepharose 2B (patrz ćw. 7.63)

4.7. CHROMATOGRAFIA POWINOWACTWA 4.7.1. Podstawy teoretyczne

Do różnorodnych procesów biotechnologicznych, a także wielu analiz biochemicznych trzeba użyć substancji biologicznie czynnych o najwyższym stopniu czystości. Spełnienie tego warunku jest niezwykle trudne, czasami wręcz niemożliwe, zwłaszcza gdy substancje wyodrębnia się z zastosowaniem tradycyjnych metod preparatyw-nych. Chromatografia powinowactwa, ze względu na swe unikatowe właściwości, pozwala znacznie uprościć procedurę izolow-ania wybranej substancji jednocześnie zachowując jej aktywność biologiczną. Jest to szczególny typ chromatografii adsorp-cyjncj, w której wykorzystuje się wzajemne powinowactwo dwóch substancji. Jedna z nich. chemicznie związana z nierozpuszczalnym nośnikiem i zwana ligandcm, specyficznie adsorbuje drugą substancję, izolując ją z mieszaniny innych związków. Oddziaływanie substancji rozpuszczonej w fazie ruchomej z unieruchomionym ligandcm może mieć różny charakter, jak między I) hormonem a receptorem.

147