mikro kunicki8

320

Hindlll

Eco RI

przeciąć Hindlll i EcoRl

EcoRl

Ryc. 10-12. Wprowadzenie zmiany w określone miejsce DNA metodą mutegenezy kasetowej z użyciem dwuniciowego, syntetycznego oligonukleotydu (kasety)

mechanizmy naprawcze działają na zasadzie wycięcia uszkodzonego ^przeważnie wraz z krótkim odcinkiem przylegającego z obu stron DNA. ^tała luka zapełniona jest dzięki miejscowej, reperacyjnej syntezie DNA przez ?_eraZę 0NA I, następnie łigaza DNA likwiduje pozostałe pęknięcie. Znamy „nipę systemów reperacji przez wycinanie, w których biorą udział kolejno rodzaj^e enzymów: specyficzne glikozylazy DNA, odszczepiające uszko-, _{3 z}asady purynowe i pirymidynowe od reszt cukrowych, i endonukłeazy, l^cinając^e szkielet fosfodiestrowy w odległości kilku nukleotydów od miejsca i? ₀wego łub apirymidynowego. Drugi system reperacji przez wycinanie funkqonowania trzech białek Uvr (ang. ultraviołet resistance) kodowa-przez geny uvrA, uvrB i uvrC i jest ograniczony do reperacji dimerów tyminy -»10-13)- Endonukleolityczna i hełikazowa aktywność kompleksu białek Uvr ^adz:i do usunięcia 14-nukleotydowego odcinka zawierającego dimer. Cięcia p^lgolityczne zachodzą precyzyjnie w odległości 8 nukleotydów od końca 5' ''IfrnefU- * ^ nukleotydów od końca 3' dimera.

A^:; j_stnieje również kilka mechanizmów reperacji przez wycinanie, umożliwia-" acych usunięcie z DNA niewłaściwie sparowanych zasad powstałych w wyniku - pomyłek repłikacyjnych połimerazy DNA III (ang. mismatch repair system), fMechanizmy te usuwają źle sparowaną zasadę z nowo zreplikowanej i jeszcze ^niezmodyfikowanej (niemetylowanej) nici DNA. Najlepiej poznany mechanizm |st związany z nukleolityczną aktywnością kompleksu białkowego MutH, MutL, gutS i MutU, który wycina z nowo syntetyzowanej nici długie odcinki DNA, o długości 1000 i więcej nukleotydów. Długa, jednoniciowa luka usuwana jest przez polimerazę DNA ffl.

Poza fotoreaktywaqą i naprawą przez wycinanie, uszkodzenia DNA mogą być usuwane przez inne mechanizmy, takie jak reperacja rekombinacyjna i system

|os.

'■%’ Reperacja rekombinacyjna zachodzi po silnym uszkodzeniu DNA, prowadzącym do zahamowania replikacji i powstania luk w potomnej nici w miejscach odpowiadających dimerom tyminy lub pęknięciom matrycy. Działanie tego _;|1|; mechanizmu bezwzględnie zależy od aktywności białka RecA. Reperacja rekom-binacyjna następuje po replikacji, kiedy w komórce znajdują się dwa chromosomy lub przynajmniej część drugiego chromosomu i polega na wymianie odcinków między chromosomami siostrzanymi. Warto tu nadmienić, że opisany mechanizm nie usuwa istniejącego uszkodzenia, lecz prowadzi do jego „rozcieńczenia" w puli cząsteczek DNA, co umożliwia replikację i przeżywalność komórek.

Skomplikowany, indukowalny system SOS, podobnie jak reperacja rekombinacyjna, uruchamiany jest po silnym uszkodzeniu DNA. Induktorem systemu jest obecność jednoniciowego DNA i wolnych oligonukleotydów, a poziom enzymów biorących udział w różnych mechanizmach naprawy (białko RecA, białka Uvr) znacznie rośnie. Unikatową cechą systemu SOS jest możliwość błędnej naprawy prowadzonej w celu usunięcia hamujących replikację luk i pęknięć DNA. Ta błędna, prowadzona „za wszelką cenę" naprawa DNA, związana jest ² funkcjonowaniem białek UmuC i UmuD. Białka te prawdopodobnie nadają polimerazie DNA III zdolność do losowego włączania nukleotydów do nowo syntetyzowanej nici, co z kolei stwarza możliwość powstawania mutacji.

321