scan0046 2

30

3.3.2. Selekcja mutantów

Selekcja mutantów to zespól technik, które mają zapewnić szybką i efektywną ocenę efektów mutagenezy i wyodrębnienie ewentualnych komórek o pożądanych cechach.

Znanych jest wiele metod oceny:

1.    Hodowle ze wskaźnikami chemicznymi. Są to testy wykorzystujące odpowiednie indykatory do szybkiej, pól ilościowej oceny zróżnicowania kolonii mikroorganizmów. Na przykład wskaźniki pH mogą służyć do wykazywania produkcji kwasów lub zasad. Skrobia (reakcja z jodem) jest używana do oznaczania wytwarzanych enzymów amylolitycznych. Producentów enzymów celulolitycznych wyróżnia się przez zastosowania pożywek z celulozą barwioną czerwienią Kongo.

2.    Wskaźniki mikrobiologiczne. Do tej grupy należą m.in. techniki tworzenia replik za pomocą welwetowego stempla - kolonie wyrosłe na replikach są stosowane do testowania, zaś wyjściowa płytka służy do izolacji wybranych kolonii. Stosowana jest również tzw. metoda krążków agarowych -wycięte jałowo krążki podłoża inkubuje się i przenosi na płytki z drobnoustrojem testowym. Wokół kolonii drobnoustrojów produkujących antybiotyki nie będą rozwijały się drobnoustroje testowe. Wokół kolonii produkującej aminokwasy będą się rozwijały organizmy testowe wymagające danego aminokwasu.

3.3.3. Adaptacja mikroorganizmów

W pracach nad udoskonalaniem producentów określonych metabolitów często stosowane są różnorodne techniki adaptacji. W przypadku metabolitów pierwotnych istotne znaczenie ma zbadanie mechanizmu kontroli wytwarzania danego metabolitu. Z tego punktu widzenia metody uzyskiwania pożądanych wariantów mogą być następujące:

1)    modyfikacja organizmu, tak aby kluczowy enzym kontrolujący drogę asymilacji był wydzielany poza komórkę, np. w wyniku pewnej anormalności w przcnikalności błony komórkowej;

2)    modyfikacja organizmu, tak aby nie wytwarzał końcowego produktu kontrolującego drogę asymilacji;

3)    modyfikacja organizmu, tak aby nie rozpoznawał obecności inhibitora lub represora.

Szczególnie przydatne są różnego typu auksotrofy. Są to mutanty (inwa-rianty) z zaburzonym metabolizmem, np. z przerwanym łańcuchem syntezy jakiegoś metabolitu pośredniego. W rezultacie mogą być nadproducentami innego metabolitu pośredniego. Auksotrofy wymagają do wzrostu obecności w podłożu metabolitu, którego nie są w stanie same syntetyzować.

Przykłady

1.    Dla bakterii produkujących kwas glutaminowy można modyfikować przepuszczalność ścian komórkowych przez kontrolę stężenia biotyny w roztworze. Przy niskich stężeniach biotyny bakterie (Corynebacterium gluta-micum) wydzielają kwas glutaminowy, zaś przy stężeniu biotyny optymalnym dla wzrostu, bakterie te wytwarzają kwas mlekowy.

2.    Często stosowana jest następująca technika służąca selekcji auksotrofów: hoduje się mikroorganizmy w pożywce minimalnej i dodaje antybiotyk, np. penicylinę, który działa wyłącznie na formy wegetatywne. Komórki proto-troficzne mogące rozwijać się w takim środowisku podlegają działaniu antybiotyku i są niszczone. Przeżywają jedynie auksotrofy. Po usunięciu penicyliny z roztworu, kulturę przenosi się do medium złożonego, umożliwiającego rozwój auksotrofów.

3.    Można w wyniku selekcji znaleźć mutanty odporne na analog danego metabolitu, co w rezultacie daje nadprodukcję danego metabolitu (np. aminokwasu).

Również przy produkcji enzymów istotne jest wyselekcjonowanie szczepów produkujących zwiększone ilości enzymu.

Enzymy kataboliczne mogą być kontrolowane w następujący sposób:

1)    Indukcja — enzym jest wytwarzany jedynie w obecności określonej substancji zwanej induktorem, stanowiącej zwykle substrat,

2)    Sprzężenie zwrotne (represja zwrotna) - synteza enzymu jest represjonowana przez produkt powstający w wyniku działania enzymu,

3)    Represja kataboliczna -- synteza enzymu jest represjonowana gdy organizm szybko wzrasta na łatwo utylizowanym substracie-źródlc węgla.

Przykłady

1.    Mutanty, które normalnie produkują enzymy indukowane pod nieobecność induktora nazywa się mutantami konstytutywnymi. Można je wyhodować np. w chemostacie wobec induktora jako substratu limitującego wzrost — przy niskim stężeniu takiego substratu może nastąpić pożądana adaptacja — mutanty konstytutywne mają przewagę rozwojową. Otrzymano w ten sposób mutanty konstytutywne wobec galaktozydazy w wyniku hodowli ciągłej na laktozie stanowiącej induktor. Można również przenosić kilkakrotnie kulturę pomiędzy pożywki zawierające i nie zawierające induktora. Można również stosować hodowle na substracie stanowiącym słaby induktor, np. producentów galaktozydazy na fenylo-galaktozie jako źródle węgla.

2.    Selekcja szczepu odpornego na hamujące działanie jakiegoś represora (np. aminokwasów) może prowadzić dc otrzymania nadproducenta określonego metabolitu hamowanego przez ten sam czynnik (np. w ten sposób otrzymano producenta proteaz* przez wyhodowanie bakterii Bacillus odpornej na aminokwasy — wytwarzanie proteaz normalnie jest represjonowane przez aminokwasy).