(4)

elektroforezy ich pozycje będą następujące: białko o budować pierwotnej (O) i produkt mutacji O będą zlokalizowane w tej samej odległości od linii startu. W tej samej odległości będzie zlokalizowany produkt zmutowanego genu O, identyczny z białkiem pierwotnym (O). Produkt mutacji O będzie się znajdował bliżej linii startu, gdyż jego ładunek wypadkowy wynosi * 2, a więc jest mniejszy w stosunku do białka pierwotnego, a produkt mutacji © o ładunku +1 będzie najbliżej linii startu. (Wg.npmwutm Traciicniiswyme

gauetie;', Rllis Horwood Lid Publishos, Chichester 1988)

Wykonanie

1.    Złożyć aparat do elektroforezy, napełnić zbiorniki buforami.

2.    Przyniesione próbki roślinne (np. liście dwóch spokrewnionych gatunków lub tego samego gatunku z różnych siedlisk itp.) umieścić w moździerzu do którego uprzednio wlano ciekły azot (Ostrożnie!). Rozetrzeć w azocie na drobny proszek. Po odparowaniu azotu umieścić w probówkach Eppendorfa i podpisać. Przechowywać na lodzie.

W razie braku ciekłego azotu homogenizować w' niewielkiej ilości buforu w homogenizatorze szkło-szkło.

3.    Do próbek w probówkach Eppendorfa dodać po 500 pi buforu zagęszczonego sacharozą i dokładnie wymieszać.

4.    Pipetą automatyczną nanosić próbki do studzienek w dwu żelach - po 50 i 200 pi; w dwu studzienkach każdego żelu umieścićpo 20 lub 50 pl roztworu oczyszczonej reduktazy ferredoksyna-NADP^f z dodatkiem błękitu bromofenolowcgo. Prowadzić elektroforezę do momentu gdy błękit bromofenolowy znajdzie się ok. 0.5 cm od dolnej krawędzi żelu.

5.    Odłączyć prąd, rozmontować aparat, wyciągnąć żele.

6.    Jeden z żeli poddać barwieniu wykazującemu obecność diaforaz zależnych od NADPH: umieścić w roztworze barwiącym (ostrożnie - zawiera bardzo szkodliwe związki) w ciemności i sprawdzać intensywność zabarwienia co 5-10 min. Po otrzymaniu wyraźnego zabarwienia odczekać jeszcze 10 min, żel wyciągnąć z kąpieli barwiącej, wypłukać w kiuwecie fotograficznej kilkakrotnie wodą w'odociągową, delikatnie osuszyć bibułą i włożyć między dwa arkusze folii. Odrysować otrzymany układ prążków, zaznaczając miejsca naniesienia poszczególnych próbek. Można również otrzymać kopię żelu za pomocą kserografu.

7.    Drugi z żeli poddać barwieniu srebrem w celu uwidocznienia wszystkich białek: Opracowanie wyników:

Na podstawie otrzymanych wyników:

podać liczbę izoenzymów diaforaz w badanych próbkach

porówTiać profil izoenzymalyczny badanych roślin