2

I Metody oznaczania białka łl

Wadą metody, podobnie jak i metod; 1    _: : •»ap . iwuiaii •* lVii^lUiib

barwnika przez różne białka. Prócz tego niektóre detergenty, takie jak sól sodowa siarczanu dodecylu (SDS)czy Triton X-100 dają w połączeniu z barwnikiem dodatkowy zakłócający kolor. Związki te przeszkadzają w uzyskaniu miarodainych wyni-

...... •!.<> . IA    .b.

t*. w-^m. W...WJ ..    m m zaleca się wykonanie oznaczeń

stężenia białek standardowych przy każdym oznaczeniu białka ww. metodą.

METODYKA

Odczynniki:

1.    Roztwór podstawowy barwnika: 100 mg Coomassic Bniliat Blue G-250 rozpuść w 50 cm^} 95% etanolu, dodaj 100 cm’ kwasu ortoforf■.; i cbj.; tość mieszaniny uzupełnij wodą destylowaną do 200 cm’. Roztw ór podstawowy przechowywany w ciemnej butli jest trw ały. Przed użyciem 1 objętość roztworu podstawowego rozcieńcz ' <*h!-To«ęń— wody destylowanej. Trwałość takiego roztworu przechowywanego w lodówce w ciemnej butli wynosi 2 tygodnie.

2.    Roztwór standardowy albuminy: 500 pg cm’ (0,5 mg/cm¹). Z roztworu podstawowego przygotuj przez rozcieńczenie za pomocą 0,9° o NaCl po 1 cm’ roztworów o stężeniach: 50. 100, 200. 300 i 400 pg cm^?.

3.    Surowicę krwi ludzkiej do oznaczeń rozcieńcz 30 i 100 razv O.y « roztworem NaCl.

Wykonanie krzywej wzorcowej i oznaczenia:

Do 50 mm⁵ (pl) standardowych roztworów białka (50 1000 pg.cm lub surowicy krwi dodaj 2,0 cm¹ roztworu barwnika. Próby dokładnie wymieszaj (unikaj spienienia), a następnie po 15 min, lecz przed upływem 60 min, dokonaj pomiaru soektrofotomctrycznego względem próby zerowej (niezawicrającej białka) przy .iugoawi fali k ^r 595 run.

Oblicz współczynnik kalibracji W i wykreśl krzywą wzorcową.

Oznacz zawartość białka w badanej próbie (surowica krwi). Przy obliczeniu wykorzystaj wyznaczony współczynnik kalibracji W.

LITERATURA

1.    M. M. Bradford. A rapid andsensilń* methodfor the quantitalion of microgram quanti-tits of protein utilizing the principle ofprotein dye binding, Anal. Blochem., 72 (1976). ■•48-254.

2.    Bio-Radprotein assay, Technical Bulletm, No. 1051.

3.0. H. Lowry, N. J. Rosebrough, A. L. Fan, R. J. Randall, Protein rr.rariirwnr wfth the Folin phenoi reagent. J. Biol. Chem.. 193 (1951), 265-275.