DSC01611

Peroksydazy mogą równic/ katalizować reakcję bezpośredniego utlenienia substratów z udziałem tlenu cząsteczkowego.

Peroksydazy występują w roślinach wyższych, drożdżach, grzybach nitkowatych, bakteriach oraz w tkankach zwierzęcych. Jednym z najbogatszych źródeł peroksydazy jest korzeń chrzanu, z którego wyizolowano enzym w stanie krystalicznym (m.cz. 44 100 Da). Z enzymów pochodzenia zwierzęcego można wymienić np. werdoperoksydazę leukocytów czy laktopero-ksydazę występującą w mleku.

Oznaczanie aktywności peroksydazy. Aktywność peroksydazy może być oznaczana na podstawie spadku stężenia zarówno nadtlenku wodoru (H2O2) jak i donora wodoru. Zwykle stosowana jest tizecia metoda opierająca się na pomiarze poziomu utworzonych produktów utlenienia. Przy oznaczaniu aktywności enzymów z reguły substraty stosuje się w dużym nadmiarze, jednakże nadtlenek wodoru może być stosowany tylko w niewielkim nadmiarze z uwagi na jego inaktywujące działanie (w wyższych stężeniach) na białka enzymów. Reakcja ma więc charakter zerowego rzędu tylko w krótkim czasie ze względu na wyczerpywanie się H₂0₂. Z tego powodu przy oznaczaniu aktywności peroksydaz reakcję prowadzi się 5-10 min.

Zasada stosowanej metody. Metoda opiera się na reakcji utlenienia pirogalolu do pur-purogaliny przy udziale nadtlenku wodoru (rys. 25).

piroęalot

RYS. 25. Utlenienie pirogalolu do purpurogaliny

Miarą aktywności peroksydazy jest ilość utworzonej w określonym czasie purpurogaliny — barwnika, którego stężenie oznacza się fotometrycznie. Aby wyeliminować wpływ na wynik oznaczenia aktywności oksydazy polifenolowej, często występującej w materiale roślinnym i również zdolnej do utleniania pirogalolu (lecz bez udziału H₂0₂), wykonuje się próbę materiałową bez dodatku H₂0₂i uzyskaną wartość absorbancj i odejmuje się od wartości absorbancji dla próby pełnej.

Warunki oznaczania aktywności peroksydazy chrzanu: pH 7,0, temp. 25°C, czas działania 10 min.

Odczynniki

1.0,2-molowy bufor fosforanowy (potasowy) pH 7,0.

2. 0,2-molowy roztwór pirogalolu — 25,2 g rozpuścić w 1 1 wody (przygotowywać bezpośrednio przed ćwiczeniem, przechowywać w oranżowej butelce).