img038

4.2. Zastosowanie lmmobiiizowanej P-fruktofuranozydazy do hydrolizy sacharozy.

Odważyć na wadze analitycznej, wskazaną przez prowadzącego, porcję preparatu immobilizowanej w żelu PVA-alginian p-fruktofuranozydazy i umieścić w zamykanej buteleczce (kolbce) o objętości ok. 100 ml. Dodać do buteleczki 10 cm³ 3%-owego roztworu sacharozy i umieścić ją w termostatowanej wstrząsarce o temperaturze 40°C (próba właściwa). W tych samych warunkach umieścić drugą buteleczkę zawierającą roztwór sacharozy bez preparatu enzymu (próba materiałowa).

Próby wstrząsać przez dokładnie( I) 30 minut w temp. 40°C, następnie oznaczyć ilość cukrów redukujących powstałych w efekcie hydrolizy sacharozy (metodą Samogoy-Nelsona).

Określenie stężenia cukrów redukujących w hydrolizatach sacharozy (metoda Samogoy-Nelsona).

Przed analizą wykonać rozcieńczenia hydrolizatów sacharozy wg wskazań prowadzącego zajęcia. Po czym pobrać po 1 cm³ rozcieńczonych próbek do probówek i dodać do każdej po 1 cm³ odczynnika miedziowego. Równolegle wykonać próbę odczynnikową zawierającą 1 cm³ wody i 1 cm³ odczynnika miedziowego. Wszystkie próbki wstawić do wrzącej łaźni wodnej (100°C I!) i gotować dokładnie 10 minut, następnie natychmiast schłodzić. Po schłodzeniu dodać do każdej próby po 1 cm³ roztworu Nelsona i dokładnie wymieszać aż do zaniku pojawiania się pęcherzyków gazu. Po 10 minutach zmierzyć absorbancje prób (właściwej i materiałowej) wobec próby odczynnikowej przy długości fali 520 nm. Analizy wykonać w dwukrotnych powtórzeniach.

• Stężenie cukrów redukujących obliczyć wg wzoru:

c [iimoltiukerjcm'³ ] = K • AEsjo- R

gdzie:

K[|nnolgiuko*yCtn‘³] - współczynnik obliczony na podstawie krzywej wzorcowej (podany przez prowadzącego)

AE520 - różnica absorbancji między badaną próbą (właściwą lub materiałową) a próbą odczynnikową

R - rozcieńczenie próby przed analizą

I Wiązanie na powierzchni nośnika:

A - adsorpcja, adhezja (lub kolonizacja drobnoustrojów w materiałach porowatych) na nośnikach: nieorganicznych (szkła porowate, tlenki metali, piasek, węgiel aktywny, wymieniacze jonowe, hydroksyapatyty, żele fosforanu wapnia, żel krzemionkowy) i organicznych (pochodne celulozy, chityny, żywice jonowymienne, polimery).

Wiązanie biokatalizatora z nośnikiem zachodzi dzięki oddziaływaniom jonowym, wodorowym, hydrofobowym oraz van der Waal’sa.

Jest to metoda najprostsza i najtańsza, ale nie zapewniająca trwałego związania enzymu, gdyż zmiana siły jonowej lub pH środowiska reakcji może powodować desorpcję biokatalizatora z nośnika.

B - wiązanie kowalencyjne biokatalizatora z powierzchnią nośnika przez utworzenie wiązań: peptydowych, estrowych, diazoniowych, typu C-C lub C-N, przy zastosowaniu rożnych odczynników aktywujących i wiążących, np. diamin, dialdehydu glutarowego, bromocyjanianów, izomocznika i in. W metodach tych stosuje się jako nośniki: szkło porowate, ceramikę, CM-celulozę, chitynę, agarozę, kolagen, poliuretany, nylon, polistyren, żele krzemionkowe, magetyt, tlenki metali, itp.

II Wiązanie w matrycy nośnika:

C, D, E - pułapkowanie w żelach naturalnych (alginian, celuloza, agar, agaroza, pektynian, chitozan, modyfikowana skrobia, żelatyna, kolagen) lub syntetycznych (poliuretan, żywice epoksydowe, alkohol poliwinylowy i jego pochodne, poliakrylamidy). Metoda polega na zmieszaniu biokatalizatora z monomerem(ami) lub rozpuszczalnym polimerem i przeprowadzeniu procesu polimeryzcji czy polikodensacji lub też usieciowania (żelowanie termiczne, jonotropowe) w celu utwardzenia żelu w postaci membran, kuleczek lub włókien.

HI Zamykanie wewnątrz membran półprzepuszczalnych (nylonowych, celulozowych, liposomalnych) przez:

kapsułkowanie lub mikrokapsułkowanie (F), pomiędzy membranami lub w wężach półprzepuszczalnych (G) z odpowiednich polimerów syntetycznych.

Stosuje się tu membrany półprzepuszczalne z nylonu, nitrocelulozy, etylocelulozy, polistyrenu i fosfolipidów o wielkości por 1-100 pm.

IV Unieruchamianie bez makroskopowego nośnika mechanicznego, przez:

kopolimeryzację enzymów lub komórek drobnoustrojów z nośnikiem rozpuszczalnym