Obraz6

J)    Około 50 mM roztwór MSO4

K)    Odczynnik Bradford 2.3. Postępowanie

•    Kolumny 1,5x10 cm napełnić zawiesiną żeli (A), tak aby po sedymentacji wysokość złoża wynosiła 5 cm.

•    Przemyć każdą z kolumn 20 ml buforu startowego

Uwaga: podczas przemywania i elucji nie dopuścić do zapowietrzenia kolumny.

Zamknąć wylot kolumny

•    Nanieść na każdą z kolumn po 10,0 ml lizatu bakteryjnego (G), rozpocząć zbieranie frakcji o objętości 2,5 ml używając kolektora frakcji (lub manualnie, przy pomocy cylinderka miarowego na 10 ml). Po naniesieniu preparatu zamknąć wylot kolumny i ostrożnie po ściankach nanieść bufor startowy.

•    Przemyć kolumny 25 ml porcjami odpowiedniego buforu i zbierać frakcje o objętości 2,5 ml :

TALON	IDA-Sepharose
1. Bufor startowy (B)	1. Bufor startowy (B)
2. Bufor ( C )	2. Bufor ( D )
3. Bufor (E) elucja	3. Bufor ( F ) elucja

•    Po zakończeniu chromatografii oznaczyć zawartość białka w lizacie oraz w zebranych frakcjach metodą Bradford:

50 ul frakcji

+ 2,0 ml odczynnika Bradford

Próby wymieszać i dokonać pomiaru spektrofotometrycznego przy 595 nm wobec próby ślepej

Dokonać pomiarów spektrofluorymetrycznych ( X _ex ⁼ 405 nm, X nm⁼510 nm) zebranych frakcji zawierających rGFP celem wyznaczenia szczytu Zachować i przechować w -2(fC porcję lizatu i oczyszczonego preparatu do elektroforezy

•    Regeneracja kolumn

Przemyć każdą z kolumn 15 ml porcjami : wody, następnie roztworem EDTA (celem usunięcia jonów metali - nastąpi odbarwienie kolumny), ponownie wodą, po czym odpowiednio: roztworem C0CI2 (Talon) lub NiSCh (IDA), wodą i na koniec buforem startowym.

3.    Opracowanie wyników

Przedstawić przebieg chromatografii na wykresie (Sigma Plot), oszacować w przybliżeniu stopień oczyszczenia GFP na podstawie ilości usuniętych białek balastowych. Porównać rozdziały na obu nośnikach.

4.    Literatura

[1]    Kagedal L - Immobilized Metal łon Affmity Chromatography, w: Janson,J-Ch.

Ryden L.(wyd) Protein purification.Principles,high resolution methods and applications Wiley-VCH 1998

[2]    Yip T-T, Hutchens T.W. Immobilized Metal łon Affmity Chromatography, w:

Kennedy AS.,Fowell S., - Methods in molecular biology Vol. 11: Practical protein chromatography. Humana Press Inc., 1992 literatura dostarczona przez prowadzących zajęcia

n