skanuj0008

Odczynniki:

•    100 mM roztwór buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierający 20 mM a-ketoglutaran

•    350 mM roztwór alaniny w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0

•    2,5 mM roztwór NADH + ET w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0

•    roztwór dehydrogenazy mleczanowej o aktywności około 1,2 jednostki w 100 pl (roztwór przygotowany w 100 mM buforze Tris-HCl, pH 8,0

Materiał:

Odważyć 1 g niedojrzałych nasion grochu (zielony groszek), przenieść do małego moździerza i rozetrzeć, najpierw „na sucho”, a potem dodając 1 ml 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0. Dobrze roztarty materiał przenieś do probówek Eppendorfa i odwirować 5 min przy 15 000 obr./min. Do oznaczeń używać klarownego nadsączu (supematantu) rozcieńczonego 5x buforem używanym do homogenizacji.

Wykonanie:

Do kuwety kwarcowej napipetować 500 pl 100 mM buforu Tris-HCl, pH 8,0 zawierającego 20 mM a-ketoglutaran, następnie dodać 100 pl roztworu NADH + H⁺, 100 pl dehydrogenazy mleczanowej i 100 pl ekstraktu tkankowego (rozcieńczonego nadsączu). Kuwetę umieścić w spektrofotometrze i sprawdzić stabilność układu, a następnie reakcję transaminacji zapoczątkować dodając 200 pl 350 mM roztworu alaniny. Mierzyć spadki absorbancji przy 340 nm przez około 10 min, a następnie policzyć średnią wartość zlA/min.

• Obliczyć aktywność aminotransferazy alaninowej wyrażonąjako ilość nmoli pirogronianu powstałego w reakcji enzymatycznej w ciągu 1 min.

6