PCR (3)

W trzecim cyklu pojawiają się po raz pierwszy fragmenty o odpowiedniej długości, zdeterminowanej przez sekwencje starterów (rys. 4d, c, 0- Od tego momentu zaczyna się wykładnicza synteza fragmentów DNA wyrażona równaniem: (2" 2/t),v, gdzie: n - liczba cykli, 2n - produkty pierwszorzędowego i drugorzędowego wydłużania starterów o nieokreślonej długości, x - początkowa liczba kopii matrycy. Po trwającym około 2 godzin procesie fragment, który stanowi mniej niż jedną milionową zawartego w próbce DNA. zostaje selektywnie powielony tak, że staje się dominującym składnikiem mieszaniny (co najmniej 98%). Po 30 cyklach reakcji z 1 kopii matrycy DNA powstanie:

(2^ł0 - 2 • 30) • 1 = 1 073 741 824-60 - 1 073 741 764 kopii DNA.

Przytoczone wyżej parametry są oczywiście tylko przykładem, w rzeczywistości czas trwania poszczególnych etapów reakcji, liczba cykli, wartości temperatury i stężeń substratów są w szerokich granicach modyfikowane w różnych wariantach PC’R.

4.2. Odczynniki wykorzystywane w reakcji PCR

Polimeraza Taq - polimeraza lermostabilna. F.nzym nietracący swych właściwości w temperaturze de-naturacji dla innych białek. Polimeraza izolowana jest z bakterii Thermus aquaticus lub Thermus thermophilus, ale także od rekombinanta Escheńchia coli. Polimerazy wykorzystywane do PCR są tak zmodyfikowane, że nie mają aktywności endo- i egzonukleolitycznych, tracą więc zdolność do sprawdzania i korekty błędów replikacji. Polimerazy DNA różnią się między sobą przede wszystkim efektywnością polimeryzacji, ale także i częstośeią występowania indukowanych przez enzym błędów. Jedna jednostka tego enzymu jest definiowana jako jego ilość zdolna do katalizow ania inkorporacji do kwasu nukleinowego 10 nM nukleotydów w czasie 30 minut w temperaturze 74°C. Trójfosforany deoksynuk 1 cotydów    deoksynukleozydolrifosforany (dNTP: dATP, dCTP. dGTP

i dTTP). Substraty reakcji dostarczające energii do jej przebiegu. Wskazane jest, aby stężenie każdego z nich było jednakowe.

Para starterów. Zapewnia specyficzność reakcji PCR. Są to syntetyczne krótkie fragmenty oligonu-klcotydowc, które są tak dobrane, aby komplementarnie hybrydyzowały z fragmentami DNA na obu niciach matrycowych przed i za interesującym nas fragmentem DNA. Długość starterów po-winna liczyć około 20 nukleotydów. Z czterech różnych nukleotydów możemy ułożyć 4" różnych n-nukleotydowych sekwencji. Dwudziestonukleolydowy fragment posiada niewyobrażalną liczbę kombinacji i niemożliwe praw ie jest, by takow a kombinacja pojaw iła się przy innym genie. Końce y starterów nie powinny zawierać zdegenerowanyeh kodonów (np. Met) oraz nie powinny być komplementarne do siebie ani palindromiczne. W projektowaniu sekwencji starterów należy unikać nierównej obecności rejonów' bogatych w^f G/C lub w AT.

Bufor do reakcji PCR. Zapewnia odpowiednie środowisko dla polimerazy-. Zakres pH buforów, w zależności od firmy, wynosi od 8,3-8,8. Stężenie Tris-HC! waha się w granicach: 10-50 mM, MgCl, -jako źródło Mg²*, często występuje także KC1 w stężeniu 50 mM, gdyż właśnie to stężenie określa się jako najbardziej stymulujące Taq polimerazę.

Kationy Mg²'. Wiązane są przez startery, polimerazę, dNTP oraz matrycę DNA. Dokładność reakcji PCR jest wprost proporcjonalna do stężenia w-olnyeh jonów Mg²\ Ich stężenie powinno nieco przewyższać stężenie dNTP, co zw iększa dokładność polimerazy.

Woda destylowana, jałowa o najwyższej czystości.

Reakcję PCR należy wykonywać w obecności kontroli pozytywnej i negatywnej. Kontrola pozytywna to scharakteryzowana już wcześniej próba wykonywana w celu sprawdzenia efektywności i specyficzności reakcji PCR. Kontrola negatywna jest tzw. próbą odczynnikową, w której zamiast DNA dodawana jest woda jałowa. Kontrola ta ma na celu sprawdzenie czystości odczynników wykorzystywanych w reakcji PCR. Skład przykładów-ej reakcji PCR zamieszczono w- tabeli 5.

29