PCR (4)

4.3. Czynniki fizyczne i chemiczne wpływające na efektywność reakcji PCR i zakłócające jej prawidłowy przebieg

Typ termocyklera (icrmocyklery o zwiększonej czułości). Rodzaj probówek (probówki o zmniejszonym parowaniu).

Temperatura denaturacji, czas hybrydyzacji starterów, czas trwania cyklu, liczba cykli:

w niskiej lemperatur/.e startery mogą hybrydyzować z wieloma miejscami w genomie, które są tylko częściowo komplementarne,

temperatura przyłączania starterów musi być dobierana empirycznie; temperaturę topnienia (temperatura, w której 50% starterów jest związanych z matrycą, a pozostałe 50% niezwią-zanych znajduje się jeszcze w roztworze mieszaniny reakcyjnej) można obliczyć według następującego wzoru: T_m= 2(A + T) + 4(G + C), gdzie: A t T - suma zasad adeniny i tyminy w sekwencji startera; C ■+■ G - suma zasad guaniny i cytozyny w sekwencji startera; zawartość GC powinna stanowić 50-60% całej sekwencji; optimum temperatury wydłużania starterów musi być wyższe niż temperatura topnienia T_n.

najczęściej popełnianym błędem jest wykonanie zbyt wielu cykli reakcji, jeśli po 35 cyklach nie otrzymujemy produktu reakcji PCR, to powinniśmy zwiększyć jej wydajność, a nic zwiększać liczby cykli reakcji PCR, gdyż półokres aktywności polimerazy zależy od temperatury i wynosi około 2 godzin w temperaturze 92,5°C, w temperaturze 95,0^cC maleje do 40 minut, a w 97,5°C ograniczony jest do 5 minut.

Jakość i stężenie substratów w reakcji. Nadmiar starterów, a także polimerazy prowadzić może do powstania niespecyficznych produktów.

Ilość i czystość matrycy DNA. Bardzo silny efekt hamujący aktywność polimerazy wywierają nawet śladowe ilości SDS, EDTA, fenolu, heparyny oraz soli w próbce.

Wydajność syntezy Taq polimerazy zależy głównie od: temperatury, stężenia jonów Mg-⁴, struktury drugorzędowej matrycy, stężenia dNTPs.

Stężenie magnezu 2 mM daje maksymalną aktywność Taq polimerazie, a przy 10 mM jej aktywność spada mniej więcej o 50%, a także zmniejsza specyficzność przyłączania się starterów.

4.4. Wybrane modyfikacje reakcji PCR

4.4.1. Multipleks PCR

Opisany po raz pierwszy w 1988 roku multipleks PCR jest jednym z wariantów łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR). W metodzie tej stosowanych jest kilka par starterów jednocześnie, dzięki temu możliwe jest przeprowadzenie w jednej probówce w tym samym czasie amplifikacji od kilku do kilkunastu różnych regionów DNA. Reakcja ta oszczędza nie tylko odczynniki, ale i skraca czas wykonywanych analiz. Jest szczególnie często stosowana w przypadku analiz fragmentów mikrosatelitamych i w wykrywaniu polimorfizmu pojedynczych nukleotydów (SNP).

Aby reakcja taka przebiegła prawidłowo, muszą być spełnione następujące warunki:

amplifikowane fragmenty powinny różnić się długością, powinny być rozróżnialne w żelu agarozowym (rys. 5); jeśli istnieje podejrzenie, że ich wielkość będzie zbliżona, powinny być wyznakowane różnymi znacznikami fluorescencyjnymi, a ich rozdział elcktroforetyczny powinien być przeprowadzany w żelu poliakryloamidowym, w aparacie umożliwiającym odczyt różnych znaczników,

różnice w temperaturze topnienia poszczególnych starterów nie powinny być większe niż 5°C, w przypadku pary starterów wykazujących na przykład znacznie niższą temperaturę

— 30