CCI20111108009 bmp

azotu. Do grupy karboksylowej pirolu przyłączony jest silnie hydrofobowy łańcuch 20-węglowego alkoholu - fitolu. Różnica między chlorofilem a i b polega na tym, że w chlorofilu^ jednym z podstawników pierścienia pirolowego (przy C-3) jest grupa formylowa (-CHO), natomiast w chlorofilu O,- grupa metylowa (-CH₃). U roślin wyższych zawartość chlorofilu a w chloroplastach jest 2-4 razy wyższa niż chlorofilu b. Jeśli chlorofil ma charakter hydrofobowy, to łatwo rozpuszcza się w tłuszczach i rozpuszczalnikach, a jest prawie nierozpuszczalny w wodzie. Przy niskim pH (pH<7) następuje rozkład chlorofilu do feofityny, co następuje dzięki wypadnięciu atomu magnezu z pierścienia porfirynowego:

Chlorofil + 2H⁺ -► feofityna + Mg²⁺

Reakcja jest nieodwracalna. Powstająca rozpuszczalna w tłuszczach feofityna ma barwę brązowooliwkową (oliwkowozieloną). W silnie kwaśnym środowisku (pH«7) powstaje brunatny feoforbid, który jest dodatkowo pozbawiony fitolu i dlatego rozpuszcza się w wodzie. W silnie zasadowym środowisku powstają chlorofiliny - następuje hydroliza obu wiązań estrowych w cząsteczce chlorofilu, ale nie zachodzi wypadanie Mg²⁺, stąd chlorofiliny zachowują zieloną barwę, a ich sole potasowe i sodowe są rozpuszczalne w wodzie.

Inne czynniki powodujące rozkład chlorofilu to wysoka temperatura, tlen, i światło (może być przechowywany maksymalnie ok. 90 dni w temperaturze 4    °C,

bez dostępu światła).

Chlorofile łatwo wymieniają Mg²⁺ na jony innych metali dwuwartościowych: pochodna z Fe²⁺ ma barwę szarobrunatną, natomiast zieloną barwę utrwalają jony Cu²⁺i Zn²⁺.

Wykonanie oznaczenia

Ekstrakcja chlorofilu jest przykładem tzw. ługowania.

1.    Przygotowanie ekstraktu.

Zważyć ok. 100 miligramów zielonych liści. Liście pociąć nożyczkami na mniejsze i umieścić posługując się plastikową bagietką w probówce okrągłodennej o pojemności 10 cm^{1 2}. Pobrać 2,5-5 cm² 90% acetonu (w zależności od rodzaju liści) i zalać liście w probówce. Zakręcić korek i wytrząsać ok. 5 min. (w czasie wytrząsania nie eksponować ekstraktu na działanie światła). Wykonać pomiar absorpcji chlorofilu metodą spektrofotometryczną.

1

   Pomiary spektrofotometryczne:

2

A. Do kuwety spektrofotometru (o grubości warstwy 1 cm) odmierzyć ekstrakt chlorofilowy w ilości 0,5 cm². Zmierzyć wielkość absorpcji chlorofilu przy długości fal 663, 665, 645 i 750 nm wobec 90% acetonu jako odnośnika.

Zmiana długości fali wymaga każdorazowo zerowania przyrządu wobec roztworu odniesienia.