img048 (54)

Enzymy restrykcyjne

Pozostawiające lepkie końce

gJa TT/

stał

■•GA/łlTC-

■•CTljAAG

-"••GMTTC ••••••

-CTTYG......

Pozostawiające tępe końce

Metody inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna pozwala na tworzenie nowych kombinacji materiału genetycznego przez przyłączenie cząstek DNA skonstruowanych poza komórką do wirusa, plazmidu lub innego wektora, umożliwiającego włączenie tego materiału do genomu organizmu wybranego gospodarza. Umożliwia wprowadzenie do komórki nowych, nawet odległych genów, także usunięcie i wymianę genów istniejących. Pozwala uzyskać drobnoustroje o zupełnie nowych właściwościach, nie istniejące w świecie istot żywych.

Jej przewaga nad innymi metodami genetycznymi polega na specyficzności i możliwości uzyskiwania ukierunkowanych zmian genomu komórki.

Metody inżynierii genetycznej

Inżynieria genetyczna pozwala na łączenie fragmentów genomów pochodzących z dowolnych organizmów dzięki enzymom restrykcyjnym.

W procesie konstruowania zrekombinowanych cząstek DNA niezbędna jest dokładna znajomość m.in.: molekularnych mechanizmów funkcjonowania genów użytych do klonowania, sposobów izolowania genów z organizmów żywych lub ich syntezy chemicznej, możliwości włączania żądanych genów w odpowiedniej kolejności z zachowaniem reguł warunkujących ich efektywną ekspresję (transkrypcję i translację) oraz metod wprowadzania zrekombinowanych cząstek DNA do organizmu biorcy i zapewnienia warunków ich stabilnego funkcjonowania w ciągu dłuższego czasu.

Klonowanie DNA

Klonowanie DNA

Wprowadzenie DNA do plazmidów. Gen będący przedmiotem zainteresowania zostaje wprowadzony do plazamidu (małe cząsteczki, które się samoreplikują, pozachromosomalnie).

Połączenie końców DNA enzymatycznie - ligaza DNA. DNA jest łączony z plazmidem z zastowaniem ligazy. Powstaje cząsteczka rekombinowana - nowy plazmidowy wektor zawiera oryginalną informację genetyczną służącą replikacji plazmidu w komórce gospodarza wraz z wprowadzonym DNA.

Ponownie nowy wektor jest wprowadzany do organizmu gospodarza gdzie wiele kopii danej sekwencji genetycznej powstaje podczas gdy komórka rośnie i dzieli się zawierając replikujący wektor.

Wiele kopii nowo syntetyzowanego DNA może być wyizolowane w celu zsekwencjonowania kwasu nukleinowego lub w celu innych biochemicznych badań.

Metody inżynierii genetycznej

Na każdy proces inżynierii genetycznej składająsię: otrzymywanie fragmentów DNA, konstrukcja wektora i wprowadzenie DNA do komórki biorcy. Ostatni etap rozpoczyna proces klonowania — powstawania potomstwa zrekombinowanej cząsteczki DNA.

Istotny etap to wprowadzenie do komórki informacji genetycznej i zapewnienie jej stabilności. By wprowadzić uzyskane i zmodyfikowane DNA do komórki należy użyć wektora (przenosi DNA do pożądanej komórki). Rolę wektorów pełnią najczęściej bakteriofagi, wirusy i plazmidy.W połączeniu z wektorem cząstki DNA stająsię zdolne do samodzielnego bytu jako minichromosomy. W podziałach komórkowych ulegają replikacji i przekazywane są dalszym pokoleniom. Wektory posiadają markery (np. oporność na antybiotyki), umożliwiające selekcję komórek zawierających nowo wprowadzony gen.

Metody inżynierii genetycznej

Strategia postępowania :

-    znalezienie i wyizolowanie (lub zsyntezowanie) potrzebnego genu

-    opracowanie skutecznego sposobu przeniesienia genu do komórek biorcy

-    umieszczenie genu w pożądanym rejonie DNA biorcy

Współczesne metody inżynierii genetycznej pozwalają na wysoki poziom ekspresji klonowanego genu, przy którym produkt osiqga 10-50% rozpuszczalnych białek gospodarza.

Wpływ na wydajną ekspresję i sekrecję ma m.in.: liczba kopii wektora, charakterystyka zastosowanego promotora, stabilność mRNA, rodzaj mikroorganizmu.

Podstawowym warunkiem opłacalności wytwarzania określonego produktu biotechnologicznego jest stabilność genetyczna drobnoustroju produkcyjnego.