P1180616 [1600x1200]

polarnego) po nośniku następuje ciągłe ustalanie równowagi podziału substancji rozdzielanych pomiędzy te dwie fazy. Po zakończeniu rozwijania chromatogramu poszczególne składniki rozdzielanej mieszaniny zostają zatrzymane w różnych miejscach nośnika w zależności od wartości ich współczynnika podziału między fazę ruchomą i stacjonarną.

Wykonanie:

Przygotowanie ekstraktu barwników:

Z homogenstu otrzymanego w wyniku rozcierania liści w poprzednim doświadczeniu pobrać ciemnozieloną warstwę dolną (chloroformową), możliwi; bez fragmentów tkanek, przesączyć przez bibułę i w razie potrzeby zagęścić przez odparowanie (mieszając w zlewce włożonej do ciepłej wody, pod digestorium). Część ekstraktu (ok. 1 ml) odlać do probówki i dodać do niej 20-50 pi stężonego HCI.

Przeprowadzenie rozdziału

Na bibule chromatograficznej o wymiarach ok. 23x15 cm narysować ołówkiem 2 linie startu, w odległości ok. 2.5 cm od dłuższej krawędzi bibuły. Następnie na te linie nanieść kilkakrotnie pipetą Pasteura otrzymane ekstrakty, susząc miejsca nanoszenia strumieniem zimnego powietrza z suszarki. Bibułę spiąć w walec i umieścić w komorze chromatograficznej o poj. ok. 11 zawierającej na dnie warstwę ok. 1 cm mieszaniny o składzie benzyna : aceton 125:15 (v/v). Rozdział prowadzić do momentu osiągnięcia przez czoło rozpuszczalnika górnej krawędź-. bibuły. Następnie chromatogram wyjąć ze zlewki i wysuszyć. Obrysować ołówkiem widoczne na chromatogramie barwne plamy, wyciąć obrysowane fragmenty bibuły pokroić na drobne paseczki i wyekstrahować barwniki acetonem. Wykonać widma absorpcyjne tak uzyskanych roztworów barwników. Określić wpływ środowiska kwaśnego na skład barwnikowy liścia.

3. Wykrywanie cholesterolu (odczyn Liebermanna-Burcharda)

Zasada: Pod wpływem stężonego kwasu siarkowego i bezwodnika kwasu octowego tworzy się zabarwiony kwas monosulfonowy bicholestadienu. Reakcję tę wykorzystuje się także do ilościowego oznaczania cholesterolu metodą spektrofotometryczną.

Wykonanie: Badanąpróbkę rozpuścić w chloroformie; jeżeli utworzyła się górna warstwa wodna, to zebrać warstwę dolną (chloroformową), dodać do niej bezwodnego siarczanu magnezu (w celu odwodnienia) wytrząsnąć przez 2 min, odstawić i po chwili zebrać ciecz znad osadu. 0.5 ml roztworu zadać 1 ml bezwodnika kwasu octowego i (ostrożnie, może wyprysnąć podczas dodawania!) 150 pl stężonego kwasu siarkowego. O obecności cholesterolu świadczy zabarwienie z początku różowo-czerwone następnie przechodzące w zielone. Równoczenie wykonywać próbę kontrolną na próbce nie zawierającej cholesterolu i próbę na chloroformowym roztworze cholesterolu. UWAGA: Szkło używane do oznaczeń musi być suche!

Materiały:

Zielone liście (pszenicy, Bllbergia sp. lub Łp.) płytki do TLC pokryte żelem krzemionkowym, bibuła chromatograficzna, ew. materiał do oznaczania cholesterolu.

Odczynniki:

Wzorce lipidów, solwent do chromatografii cienkowarstwowej j.w., jod, benzyna, aceton, chloroform, metanol, bezwodnik kwasu octowego, stężony kwas siarkowy, stężony kwas solny, chloroformowy roztwór cholesterolu

Sprzęt:

Komora do chromatografii bibułowej, komora do chromatografii cienkowarstwowej, komora do barwienia w parach jodu, mlkrostrzykawka 10 pl, pipety pasteurowskle z obtopionymi końcami, suszarka, szkło laboratoryjne, pipety automatyczne 10001200 pl.