16.02.2005 Wykład 1
TEMAT: Rys historyczny rozwoju wiedzy o komórce. Podstawowe techniki stosowane w cytologii i histologii.
1655 - Hooke - skonstruował mikroskop i opisał komórki korka
1674 - Leewenhoek - odkrył pierwotniaki i bakterie (1683)
1833 - Brown - opisał jądro komórkowe
1838 - Schleiden i Schwan - teoria komórkowa (komórka jako składnik tkanek)
1879 - Flemming - opisał chromosomy podczas mitozy
1881 -Cajel - opracował metody technik barwienia komórek nerwowych
1898 - Golgi - opisał aparat Golgiego
1934 - Rousek - pierwszy mikroskop elektronowy
1952 - Palade, Porter, Sjostrand - rozwinęli metody mikroskopii elektronowej
1951 - Robertson - opisał dwuwarstwową strukturę błony komórkowej
MIKROSKOPY
ŚWIETLNE ELEKTRONOWE
Mikroskopy świetlne: (różnią się między sobą kondensorem)
mikroskopia w polu ciemnym
mikroskopia w polu jasnym
mikroskop fluoroscencyjny
mikroskop polaryzacyjny
mikroskop kontrastujący fazy
mikroskop interferencyjny
mikroskop konfokalny
mikroskop odwrócony - inwertoskop
Mikroskopy elektronowe:
mikroskop transmisyjny TEM
mikroskop wysokowoltażowy
mikroskop skeninkowy SEM
mikroskop tunelowy skenujący
mikroskop rentgenowski
mikroskop fluoroscencyjny
modyfikacja mikroskopu świetlnego
za jego pomocą oglądamy preparaty sporządzone przy użyciu odczynników dających efekt fluorescencji
struktury komórkowe znakuje się np. przeciwciałami sprzężonymi z fluorochromami
mikroskopia w polu ciemnym
kondensator w szczególny sposób oświetla badany obiekt
do obiektywu wpadają wyłącznie promienie ugięte na strukturach obiektu, promienie przechodzące przez obiekt a nie ugięte są eliminowane
struktury rozpraszające światło są widoczne jako jasne twory na ciemnym tle
mikroskop polaryzacyjny
wykorzystuję się w nim zjawisko istnienia struktur anizotropowych (mają różne współczynniki załamania w zależności od osi, w której przebiega światło)
mierzy się dwa współczynniki załamania jako opóźnienie przebiegu promieni wolniej biegnących wobec szybszych
im większa grubość badanego obiektu tym większa różnica
znajdują się w nim dwie płytki: polaryzator i analizator zbudowane z polaryzującego światło materiału
polaryzator jest pod kondensorem, a analizator nad obiektywem
mikroskop kontrastujący fazy
stosowany do badań przeżyciowych komórek np. hodowanych in vitro
wyposażony w płytkę fazową, która przesuwa fazę światła przechodzącego tak aby w wyniku interferencji z promieniem świetlnym utworzyć obraz kontrastowy przedmiotu fazowego
w wyniku interferencji powstaje efekt interferencyjny dodatni bądź ujemny
kontrast fazowy + to są ciemne struktury na jasnym tle
mikroskop interferencyjny
do mierzenia przesunięcia fazowego światła przechodzącego przez badane struktury
nakłada się dwie lub więcej wiązek światła
za pomocą pomiaru współczynnika załamania światła można określić stężenie substancji w danych obszarach komórki, czyli podać suchą masę materii żywej
mikroskop konfokalny
źródłem światła jest laser, którego cienki promień skenuje, pole po polu, linia po linii, obserwowane pole widzenia
średnica plamki promienia laserowego to zdolność rozdzielcza mikroskopu, sięga wartości 0,1 μm
promień lasera tnie materiał na warstwy o ww grubości
pozwala na uzyskiwanie obrazów w świetle przechodzącym i w świetle odbitym, obrazy te można następnie, za pomocą komputera, dowolnie ze sobą zestawiać
transmisyjny mikroskop elektronowy (TEM)
występują soczewki magnetyczne
źródło promieniowania to katoda
obrazy powstają w wyniku rozpraszania przez dany obiekt wiązki elektronów
działo elektronowe wytwarza elektrony, które są przyspieszane przez wysokie napięcie, które jest formowane przez uzwojenia soczewek elektromagnetycznych, z drugiej strony jest ekran fluoroscencyjny
preparat musi znajdować się w próżni i być bardzo cienki
kontrast uzyskuje się przez nałożenie barwników zawierających metal ciężki, który pochłania lub rozprasza elektrony
mikroskop daje obraz dwuwymiarowy
mikroskop elektronowy skenujący (SEM)
cienka wiązka elektronów przemiata linia po linii powierzchnię obiektu badanego
wybijane z powierzchni wtórne elektrony są zbierane i wzmacniane przez fotopowielacz, a sygnały przeważane są na monitorze
uzyskiwanie obrazów 3D
Metody i techniki histologiczne:
Metody HE (hematoksylina/eozyna)
hematoksylina - barwnik zasadowy - jądro
eozyna - barwnik kwaśny - cytoplazma
Metoda histochemiczna - wykrywanie hydrolaz i dehydrogenaz
Immunohistochemia
do określania lokalizacji białek, kwasów i cukrów, używa się przeciwciał
z badaną strukturą łączą się określone przeciwciała, które oznakowane zostały fluorochromami
czasem należy dodać dodatkowo przeciwciało II, które jest połączone z substancją znacznikową i przyłącza się ono do przeciwciała I i dzięki temu są znakowane odpowiednie struktury
Hodowla tkanek
umożliwia ocenę zachowań komórek i tkanek pod wpływem różnych substancji
badania in vitro
w celu standaryzacji takich badań powstały czyste linie komórkowe
można uzyskać linie nieśmiertelne przez transformację nowotworową np. przez wprowadzenie wirusa SU40 do genomu komórki
Autoradiografia
właściwości promieniotwórcze pierwiastków można wykorzystać do śledzenia szlaków metabolicznych niektórych makrocząsteczek
do wykrywania tych radioizotopów służy emulsja fotograficzna
komórki nie rozróżniają pierwiastków od ich promieniotwórczych izotopów, którymi są znakowane cząsteczki prekursorowe
do oznakowania prekursorów metabolizmu białek wykorzystuje się aminokwasy, w których jeden z atomów C zostaje zastąpiony promieniotwórczym izotopem, można też zastąpić inne atomy np. siarkę w cysteinie
jedną z zasad DNA np. tymidynę znakujemy trytem
znakowane prekursory dodajemy do środowiska hodowlanego komórka przejmuje te prekursowy i wtapia w swój metabolizm
skrawki mikroskopowe pokrywamy emulsją fotograficzną i zostawiamy na kilka tygodni
po obróbce fotograficznej obecne w komórce izotopy promieniotwórcze emitują elektrony, które jonizują bromek srebra do srebra metalicznego
ziarna srebra w naświetlonej emulsji znajdują się nad strukturami komórkowymi, do których komórka wbudowała znakowane prekursory
4