25921 str60a

przypadku sondy molekularne, “rozpoznające” określone regiony chromosomów. Sondę molekularną stanowi w tym przypadku fragment DNA ze znaną sekwencją nukleotydów. Zasada komplementamości sprawią że sonda łączy się tylko ze specyficznymi rejonami chromosomu, zawierającymi nukleotydy komplementarne do sondy.

Technika FISH

Technika FISH (ang. fluorescence in situ hybrydization) jest modyfikacją metody ISH, wykorzystującą fluorescencyjne metody detekcji sondy. Dzięki tej metodzie można analizować chromosomy metafazowe i w jądrach interfazowych. Stanowi ona uzupełnienie metody prążkowej. Technika FISH pozwala na wykrycie addacji, translokacji, mikrodelecji.

Analiza cytometryczna.

Analiza chromosomów przy zastosowaniu cytometru przepływowego polega na ocenie zawartości DNA i/lub par zasad AT/CG w poszczególnych chromosomach, w oparciu o pomiar fluorescencji zabarwionych fluorochromem chromosomów metafazowych w zawiesinie. Technika ta umożliwia sortowanie oraz identyfikację poszczególnych chromosomów i ich aberracji.

W kolejnych etapach badania chromosomy metafazowe są izolowane z komórki, barwione fluorochromem lub dwoma fluorochromami specyficznymi dla par zasad A - T i G - C, a następnie przechodzą przez wiązkę światła wzbudzającą fluorescencję. Wyniki pomiarów względnej fluorescencji są zapisywane w postaci histogramów.

Technika ta powinna być stosowana jako metoda uzupełniającą łącznie z konwencjonalną analizą prążkową chromosomów.

Zaletami tej metody są: krótki czas oceny kariotypu (10 - 20 minut), szybkość analizy (1 000 pomiarów/sek.) oraz precyzja pomiarów (współczynnik zmienności 1 - 2%).

Ograniczeniem tej metody jest przede wszystkim brak możliwości identyfikacji niektórych chromosomów oraz trudności interpretacji wyników analizy związanej z występowaniem heteromorfizmu chromosomów.

Metodą tą nie można także rozpoznać aberracji, które nie manifestują się zmianą zawartości DNA w chromosomie np. inwersji.

Metody badań molekularnych

W genetyce medycznej stosuje się wiele technik analizy DNA, m. innymi pośrednie badanie zmutowanego genu np.badanie polimorfizmu DNA lub bezpośrednią analizę zmutowanego genu z użyciem sond oligonukleotydowych.

Bez względu na stosowaną technikę, punktem wyjścia jest DNA pochodzący od kluczowych członków rodziny, który można wyizolować z jądra komórkowego.

Anuli/ą restrykcyjna

Enzymy restrykcyjne (endonukleazy restrykcyjne) występują u bakterii, >1/niłając jako mechanizm obronny przed włączeniem obcego DNA. Ich cechą i lininktcrystycznąjest rozpoznawanie i przecinanie tylko określonych sekwencji w i zą steczce DNA (np. Eco RI z Escherichia coli RY13 rozpoznaje sekwencję < IAATTC, a Alu I z Arthrobacter luteus - sekwencję AGCT). l’od wpływem enzymu DNA zostanie pocięte na fragmenty o różnej długości.

Dzięki tym enzymom możliwe jest wykrywanie mutacji, polegającej na zmianie jednego nukleotydu.

Może nastąpić “utrata miejsca restrykcji” i wówczas zamiast dwóch fragmentów, uzyskuje się jeden dłuższy.

I Ićktem mutacji może być także “zyskanie miejsca mutacji”. Wówczas zamiast jednego fragmentu DNA otrzymuje się dwa krótkie.

I rugmenty DNA pocięte określonym enzymem restrykcyjnym, rozdziela się elcktroforetycznie w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym.

Szybkość wędrówki poszczególnych fragmentów w żelu zależy od ich wielkości.

I todanie do żelu bromku etydyny, barwnika fluorescencyjnego, wiążącego się z DNA, umożliwia uwidocznienie fragmentów DNA w postaci prążków świecących pod wpływem UV.

I lybrydyzacia

W metodzie tej wykorzystuje się zjawisko tworzenia dwuniciowych kompleksów między komplementarnymi, jednoniciowymi odcinkami kwasów nukleinowych. Możliwa jest więc lokalizacji określonych sekwencji w cząsteczce DNA.

Hybrydyzacja może zachodzić między dwiema cząsteczkami DNA, jak i między DNA i RNA. W hybrydyzacji jedną nić stanowi najczęściej fragment badanego DNA, drugą nicią jest sonda molekularna. Sondę molekularną stanowi fragment DNA o ściśle określonej sekwencji nukleotydów, uzyskany drogą klonowania lub syntezy chemicznej. Sondę należy odpowiednio oznakować. Do niedawna stosowano technikę izotopową, a celem jej wykrycia wykorzystywano technikę radioizotopową. Obecnie coraz częściej stosuje się nieradioaktywne techniki znakowania kwasów nukleinowych, a produkty hybrydyzacji wykrywane są w reakcjach barwnych lub chemiluminiscencyjnych.

Technika ta, łącznie z wykorzystaniem enzymów restrykcyjnych, umożliwia identyfikację określonych sekwencji DNA.

Analiza Southern.

Dzięki tej metodzie wykrywa się specyficzne sekwencje w mieszaninie fragmentów DNA. Przy pomocy enzymów restrykcyjnych trawi się genomowe DNA na fragmenty różnej długości, które następnie rozdziela się metodą elektroforezy. Pod wpływem podwyższonej temperatury, fragmenty dwuniciowe

61