270220121318

ryby

Tabela 11. Wpływ stresu na aktywność fagocytamą komórek krwi

Parametr WBC [MO^3 mm^1]	Kontrola		----Norrna^ ■w-ioo
Neutrofite ogółem [%]			0-30
Mtetocyty [%]			0->l S
Metamiełocyty [%]
Neutrofiłe patecztaowate [%]			0-<JS
Neutrofile segmentowane [%]
Neutronie [*lff^3 mm'^3]			12-30
NBT [g/1 formazanu]			0,8-1,2 ^
NOT [pg/komorkę]			0,02-0,1

Ćwiczenie 12. Wpływ stresu na żywotność izolowanych limfocytów krwi obwodowej

Wśród limfocytów ryb, podobnie jak u innych kręgowców, występują komórki T B oraz niespecyficzne komórki cytotoksyczne (odpowiednik komórek NK ssaków), linfocyty to komórki o działaniu cytotoksycznym oraz produkujące immunoglobuliny.

Prostym wskaźnikiem sprawności mechanizmów odpornościowych jest oznaczenie żywotności limfocytów — zawiesinę wyizolowanych z krwi i zagęszczonych komórek barwi się błękitem trypanu, który wybarwia martwe limfocyty na niebiesko. U zdrowej ryby odsetek żywych limfocytów zwykle przekracza 90%. Stres wywołuje spadek kzby limfocytów, m in. przez przyspieszenie ich apoptozy, spowodowane działaniem kort^olu.

Wykonanie oznaczenia:

1.    Około 0,5-1 cm³ krwi rozcieńcz 1:2 płynem Hanksa (lub 0,6% zbuforowa-nym roztworem NaCI).

2.    Do probówek wirówkowych wiej po 1 cm³ Gradisolu L (płyn o ciężarze właściwym 1.077 g/cm³ — takim samym jak ciężar właściwy limfocytów).

3.    Delikatnie nawarstw 1-2 cm³ rozcieńczonej krwi (uwaga! płyny nie mogą się zmieszać).

4.    Wiruj 15 minut przy 2000 obr./min.

5.    W nowych probówkach wirówkowych przygotuj po 2 cm³ płynu Hanksa.

6.    Zawiesinę (żółtawy pierścień na granicy faz) limfocytów zbierz kapilarą i przenieś do płynu Hanksa.

7.    Wiruj 10 minut przy 1000 obr./min.

8.    Zlej płyn znad osadu, a osad delikatnie zdrap z dna probówki plastikową końcówką pipety.

9 Dodaj około 2 cm³ płynu Hanksa.

10.    Wiruj 10 minut przy 1000 obr./min.

11.    Zlej prawie cały płyn znad osadu, a osad delikatnie zdrap z dna próbówki plastikową końcówką pipety i wymieszaj z pozostałym płynem.

12.    Nakropł odrobinę zawiesiny do komory Burkera i sprawdź zagęszczenie limfocytów — jeśli jest bardzo duże. dla łatwiejszego liczenia rozcieńcz, aby osiągnąć zagęszczenie około 2500-5000 komórek w mm³ (średnio 10-20 limfocytów w dużym kwadracie).

13.    Dodaj roztworu błękitu trypanu w ilości równej % objętości zawiesiny (uwaga! należy to wykonać bezpośrednio przed liczeniem, ponieważ barwnik jest toksyczny dia komórek).

14.    Nanieś kropelkę do komory Burkera. licz limfocyty (około 100), wyróżniając żywe — jasnożółte, „świecące" i martwe — niebieskie, matowe (uwaga! po naniesieniu kropli odczekaj, aż komórki osiądą na dnie komory, przy liczeniu kręć delikatnie mikrośrubą — ułatwia to identyfikację limfocytów i ocenę ich wybar-wienia. Oprócz limfocytów w próbie obecne są trombocyty (wrzecionowate komórki z długimi wypustkami cytoptazmy). a także mogą pojawić się nieliczne granułocyty (większe od limfocytów, z ciemnymi inkluzjami w środku).

15 Zsumuj żywe i martwe limfocyty, oblicz odsetek żywych. Porównaj średnie wyniki dla ryb kontrolnych i poddanych działaniu stresu.

51