64

II. Do oznaczania ilościowego DNA:

8.    Standard DNA ze śledzi (Fluka) — 73 mg DNA rozpuścić w kolbie miarowej na 10 ml w 0,005-molowym wodorotlenku sodowym.

9.    Odczynnik difenyloaminowy: 1 g difenyloaminy rozpuścić w 100 ml kwasu octowego lodowatego z dodatkiem 2,75 ml stężonego kwasu siarkowego.

Uwaga! Odczynnik powinien być przygotowany w dniu wykonywania oznaczania.

Szkło i inne pomoce

Do wydzielania i wytrącania kwasów' nukleinowych dla 3-4-osobowych grup studentów potrzebne są: 2 zlewki na 400-600 ml, cylindry: 1 na 100 ml, 1 na 250 ml, 1 na 500 ml, 1 kolba stożkowa na 1000 ml, 1 długa bagietka, homogenizator, 1 wstrząsarka, łaźnia w^rodna, wirów'ka z chłodzeniem, 1 kolorymetr.

Do sporządzania krzywej wzorcowej oraz oznaczania ilości DNA na dwóch studentów przypada: 1 statyw do probówek, 13 probówek chemicznych, 1 zlew'ka na 400-600 ml, pipeta chemiczna na 1 ml, pipety serologiczne: 2 na 1 ml, 1 na 2 ml, 1 na 5 ml, 1 kolbka miarowa na 10 ml, kolorymetr.

Wykonanie

1.    Wydzielanie kwasów nukleinowych. Odważyć 50 g zamrożonej grasicy cielęcej, rozdrobnić nożem i następnie zhomogenizow'ać w^r 200 ml roztworu chlorku sodowego z EDTA (2 ). Do 300 ml chlorku sodowego z EDTA (1 ) dodać 40 ml 25-proc. roztworu SDS (5), zmieszać z homogenatem kwasów' nukleinowych i ponownie homogenizować ok. 2 min. Uzyskany homogenat w'staw'ić w kolbie stożkowej do łaźni wodnej o temp. 60°C na 10 min, następnie roztwór schłodzić i mieszając dodać 125 ml nadchloranu sodowego (2 ). Dodać 500 ml roztworu chloroformu z alkoholem izoamylow'vm (5 ) i wytrząsać do momentu zaniku piany, co trwa ÓKT45 miń. Wirow^rać przy 4 tyś. obr./min w' ciągu 20 min. Zlać ostrożnie fazę wodną,(góma warstwa) zawierającą kwasy nukleinowe i używać jej do wykonywania reakcji charakterystycznych oraz oznaczania ilościowego.

2.    Sporządzanie krzywej wzorcowej DNA. Krzywą standardową wykonują studenci w grupach dwuosobowych w zakresie od 75 pg do 450 ug DNA w próbie. Z otrzymanego w' kolbce roztworu standardu DNA (8) pobrać w 2 powtórzeniach następujące objętości (w ml) do wykonania krzywej wzorcowej: 0,1, 0,2, 0,4, 0,6. Następnie każdą próbę uzupełnić w^rodą destylowaną do objętości 15 ml i dodać po 3 ml odczynnika difenyioaminow'ego (9). Jednocześnie przygotow-ać próbę kontrolną odczynnikowy: 13 ml wody destylowanej i 3 ml odczynnika difenyloaminowego (9 ). Wszystkie probów'ki wstawić do wrzącej łaźni i ogrzewać przez 10 min. Po ochłodzeniu wodą w'odociągow^rą do temperatur}^- pokojowej odczytać absorbancję(A) prób badanych w’obec próby kontrolnej na Spekolu przy długości fali 550 nm.

3.    Oznaczanie ilości DNA w ekstrakcie kwasów’ nukleinowych z grasicy cielęcej. Tę część ćwiczenia studenci wykonują indywidualnie. W kolbce miarowej na 10 ml otrzymują próbę kwasów' nukleinowych uzyskaną przez rozpuszczenie osadu w'ytrąconvch kwasów nukleinowych (pkt I ćwicz. 7, str. 50) i dopełniają do kreski 0,1-molowym wodorotlenkiem sodowym. Do 2 probówek należy pobrać po 1 ml roztworu z kolbki. dodać po 03 ml wody destylowanej i po 3 ml odczynnika difenyloaminowego (9 ). Próba kontrolna odczynnikowa jest taka sama