CIMG4079

Ryc. 6. Schemat dwuniriowego kwasu deoksyrybonukJeinowego (DNA). W przypadku kwasu rybonukleinowego (RNA) zamiast tyminy jest uracyl.

u zwierzęcych RNA wirusów - pikomawirusów, togawirusów i flawiwirusów; w przypadku DNA wirusów — u wirusa polioma i herpeswirusów.

Najistotniejsza rola kwasów nukleinowych polega na tym, że stanowią one materiał genetyczny, a więc genom wirusa. Jego replikacja zabezpiecza potomnej generacji wirionów te same cechy genetyczne.

W komórkach eukariotycznych i prokariotycznych genom zbudowany jest tylko z jednego rodzaju kwasu nukleinowego (dwuniciowy DNA), natomiast u wirusów zwierzęcych genom tworzą różne typy kwasu nukleinowego (wymienione w rozdziałach poświęconych określonym rodzinom wirusów - p. Część szczegółowa).

Kwasy nukleinowe można różnymi metodami wyodrębnić z oczyszczonych wirusów. Najbardziej powszechnie i z powodzeniem jest stosowana metoda ekstrakcji fenolowej. Uzyskuje się dwie fazy: dolną — fenolową z białkami i górną - z kwasami nukleinowymi. Dalsze oczyszczanie uzyskuje się po zadziałaniu etanolem. Czasami sprzyja dodanie do fenolu detergentu (np. SDS). Z innych metod należy wymienić metody oparte na działaniu detergentów w podwyższonej temperaturze, dużej zawartości soli w podwyższonej tem-

peraturze i połączenia różnych wariantów tych metod. Metoda alkaliczna polega na uzyskaniu szczególnie wysokiego pH (pH 12 i wyższe) i zadziałaniu na wirusa. Metoda z wykorzystaniem wodorochlorku guanidyny przyjmuje dezintegrację wirionu w stężeniu 2,5 mmol/1 w obecności EDTA i następnie wyodrębnieniu kwasu nukleinowego. Aby uzyskać wysoko oczyszczony preparat, metodę należy zastosować powtórnie lub zestawić różne postępowania metodyczne.

Przy analizie kwasów nukleinowych wirusów można oznaczać różne parametry, np. oznaczanie zasad, częstość określonych sekwencji nukleotydów, sekwencję zakończeń, właściwości i funkcje różnych odcinków kwasu nukleinowego, przestrzenną konfigurację, łańcuchów.

Metody stosowane do tych analiz są rozmaite. Należą do nich: absorbancja w promieniowaniu nadfioletowym (spektrofotometria), absorbancja promieniowania elektromagnetycznego (nuklearny magnetyczny rezonans), mikroskopia elektronowa, różne techniki chromatograficzne, elektroforeza, rozdział enzymatyczny.

Metoda elektroforezy polega na wędrówce cząstek w jednorodnym polu dektrycznym, w gradiencie sacharozowym, na nośnikach takich, jak żel poli-akrylamidowy, lub dwuniriowego DNA w agarozie.

W metodzie polegającej na rozkładzie kwasów nukleinowych enzymami stosuje się nukleazy: rybonukleazy, diesterazy, deoksyrybonukleazy. Nukleazy izoluje się z różnych narządów i drobnoustrojów; mają one rozmaite zdolności rozszczepiania. Duże znaczenie mają enzymy restrykcyjne, które rozszczepiają kwas nukleinowy w określonej sekwencji; np. enzym restrykcyjny Eco TI rozłącza sekwencje G/AATTC i odwrotnie CITAA/G. W następstwie powstają fragmenty, które mają różne, lecz zdefiniowane częśd łańcucha o określonym umiejscowieniu kodu genetycznego. Obecnie są znane liczne enzymy restrykcyjne (np. Barn, Ban, Cfr, Eco, Hind, San itd., w skróde oznaczone są wg pochodzenia).

BIAŁKA

Białka wirusowe tworzą kapsyd, którego istotnym zadaniem jest ochrona materiału genetycznego, jakim jest kwas nukleinowy. Zapoczątkowują procesy zakażenia przez rozpoznanie swoistości gospodarza. Z tym jest też związana właściwość białka jako antygenu. U niektórych, a mianowide większych wirusów, określone białka kodowane przez wirusa mają właściwości enzymatyczne. W genomie wirusowym znajduje się też kodon dla białek, które nie wchodzą w skład kapsydu, a które są niezbędne do replikacji kwasu nukleinowego (transkryptazy, polimerazy) i inne.

Białka wirusów mają podobny skład do białek żywych organizmów jednokomórkowych i wielokomórkowych. Odróżniają się natomiast sekwencją aminokwasów w łańcuchu polipeptydowym. Z białek wirusowych izolowano wszystkie znane aminokwasy.

Masa cząsteczkowa białka wirusowego mieści się na ogół w przedziale 18000-60000, co odpowiada całkowitej masie od 150 do 200 aminokwasów. Taka cząsteczka białkowa stanowi jedną podjednostkę wirionu. Na przykład wirus choroby mozaikowej tytoniu ma 2170 podjednostek, a więc można wnioskować, że masa cząsteczkowa białkowej podjednostki wynosi 39 x 10⁶.

31