CIMG4082

METODY ADSORPCJI I ELUCJI

Na powierzchni wielu wirusów istnieją receptory, za pomocą któr3 może wiązać się w określonych warunkach środowiskowych do pov rozmaitych komórek, w tym do krwinek czerwonych. Na przykład wirut lub parainfluenzy w temp. 4°C ulegają adsorpcji na powierzchni 1 czerwonych kurzych i ludzkich grupy 0. W temperaturze wyższej — poi do 37°C — dochodzi do elucji wirusa z powierzchni krwinek czerw Oddzielając krwinki czerwone za pomocą wirowania niskoobrotowego, 1 uzyskać wstępnie oczyszczony preparat wirusowy.

Wiele chemicznych adsorbentów, jak fosforan wapnia, wodorotlenek i kaolin, mogą służyć jako czynniki wiążące wirusy. Działając następnie zmu nym pH, zmieniając siłę jonową, można uzyskać elucję wirusa w dużym stój uwolnionego od pierwotnych towarzyszących zanieczyszczeń.

Z kolei związki tłuszczowe i białkowe, zaadsorbowane na wirionach, mo: oddzielić za pomocą enzymów lub rozpuszczalników lipidowych. Wymaga jednak takiego postępowania, podczas którego nie doszłoby do uszkodzeń własnych elementów strukturalnych wirusa.

OKREŚLANIE CZYSTOŚCI PREPARATU WIRUSOWEGO

Metody opisane poniżej są przydatne do określania kształtu, wielkości i budowy wirusów oraz jego podjednostek, a wtórnie do ustalenia właściwości wirusów.

ELEKTROFOREZA I OGNISKOWANIE IZOELEKTR YCZNE

Wirus jest nośnikiem ładunku elektrostatycznego, który zależy od tego, jakie jest pH środowiska, w którym jest on obecny, od oddalenia od punktu izoelektrycznego wirusa. Z faktu, że wirus ma ładunek elektrostatyczny wynika, że jest zdolny do migrowania, jeżeli znajdzie się w jednorodnym polu elektrycznym. Założeniem migrowania jest, aby uzyskał do tego dostateczną przestrzeń. Aby więc doszło do elektroforezy, pory muszą być dostatecznie duże. Dlatego na ogół stosuje sią agarozę w małym stężeniu (ok. 1%) albo samą, albo w połączeniu z poliakrylamidem. Zastosowanie samego p oli akryłam idu jest mniej przydatne, niezbędna bowiem wielkość porów warunkuje, aby go użyć w stężeniach 2,3—2,7%, a w tych stężeniach żel jest zbyt rzadki, aby proces przebiegał właściwie technicznie. Pewne polepszenie warunków doświadczalnych można uzyskać przez umiejscowienie żelu na folii plastykowej o zmienionej chemicznie powierzchni.

Można stosować też wolną elektroforezę w gradiencie gęstości sacharozy lub glicerolu. Po ukończeniu elektroforezy gradient można frakcjonować i analizować na obecność wirusa i związków zanieczyszczających.

Elektroforezę całych wirionów należy przeprowadzić bez użycia substancji, które mogłyby działać denaturująco, ponieważ może dojść do uszkodzenia wirusa.

Przy ogniskowaniu izoelektrycznym wirionów obowiązują podobne zasady, jak przy elektroforezie. Stosuje się środowisko, które w jednokierunkowym polu elektrycznym tworzy gradient pH. Cząstki wędrują w zależności od ładunku elektrostatycznego do momentu osiągnięcia wartości pH swojego punktu izoelektrycznego. Tą metodą można więc wiriony oddzielać i zarazem ustalić ich punkt izoelektryczny.

DYFRAKCJA RENTGENOWSKA

Oczyszczone wiriony, zwłaszcza tworzące kryształy lub parakryształy, można przebadać pod względem budowy przestrzennej ich białek za pomocą promieni rentgenowskich. Zasada polega na tym, że interferencję ugiętych promieni rentgenowskich można zarejestrować na kliszy fotograficznej.

Otrzymane rentgenogramy dostarczają informacji o wielkości i symetrii badanych cząstek. Za pomocą tej metody udało się otrzymać np. precyzyjny model wirusa choroby mozaikowej tytoniu, zbadać wielkość i liczbę podjed-nostek białkowych (kapsomerów) oraz przebieg kwasu nukleinowego między kapsomerami.

MIKROSKOPIA ELEKTRONOWA

Zdolność różnicująca każdego mikroskopu świetlnego jest uwarunkowana długością fali światła widzialnego. Ogranicza to możliwości swobodnego oglądania bakterii, riketsji i innych drobnoustrojów. W przypadku wirusów mikroskop świetlny staje się nieprzydatny. Natomiast wiązka elektronów ma przy 80 kV długość 5x 10~³ nm, która w przybliżeniu jest krótsza o ok. 100000 razy od światła widzialnego. Teoretycznie więc mikroskop elektronowy może osiągnąć powiększenie 100000 razy większe od mikroskopu świetlnego. Obecnie stosowane mikroskopy elektronowe mają zdolność rozdzielczą ok. 0,2-0,3 nm. Dzięki tak dużej zdolności różnicującej mikroskopy elektronowe znalazły zastosowanie w wirusologii do:

1)    badania budowy wirusów i ich składników,

2)    badania budowy wirionów w trójwymiarowym obrazie,

3)    optycznej analizy dyfrakcyjnej elektronogramów wirionów,

4)    badania utrwalonych preparatów wirusów,

5)    badania replikacji wirusa,

6)    wykrywania wirusowych kwasów nukleinowych metodami hybrydyzacji in situ,

7)    wykrywania wirusów i przeciwciał metodami immunoelektromikrosko-powymi i metodami immunocytochemicznymi,

8)    szybkiej diagnostyki zakażeń wirusowych (p. rozdz. poświęcony diagnostyce).

37