CIMG4085

określonych badań wirusologicznych stosowane są również zarodki innych ptaków (kacze, przepiórki japońskiej).

Szczególnie przydatne do prac wirusologicznych są zarodki pochodzące z kontrolowanych hodowli ptasich (germ free). Nie wszystkie jednak laboratoria dysponują takimi hodowlami, gdyż są one niezwykle kosztowne.

HODOWLE KOMÓRKOWE, TKANKOWE I NARZĄDOWE (ORGANOWE)

Hodowle komórkowe stały się powszechną metodą stosowaną do badań wirusologicznych we współczesnych laboratoriach naukowych, diagnostycznych, czy też produkcyjnych. W pewnych sytuacjach, głównie do badań chorobotwórczych właściwości niektórych wirusów (zwłaszcza atakujących układ oddechowy, wywołujących procesy onkogenne), stosuje się również hodowle narządowe i tkankowe.

Prowadzenie hodowli wymaga odpowiedniego sprzętu laboratoryjnego, pozwalającego na prace w jałowych warunkach, aby z jednej strony uchronić hodowane komórki przed niepożądanymi zakażeniami wirusowymi, bakteryjnymi, czy też grzybiczymi, a z drugiej strony móc badać lub izolować wyłącznie te wirusy, które są celem badań. Prace w tych laboratoriach wymagają stosowania nietoksycznych naczyń ze specjalnego szkła lub tworzyw sztucznych, odpowiednich podłoży odżywczych, zapewniających hodowanym komórkom niezbędne do żyda składniki.

Pracownie hodowli tkanek powinny być wyposażone w mieszadła magnetyczne, odpowiednie mikroskopy, deplarki. Podstawowym elementem takich pracowni są boksy z zapewnionym dopływem wyjałowionego powietrza, bądź wyposażone w lampy bakteriobójcze.

Hodowla komórek odbywa się na szkle bądź w zawiesinie. W pierwszym przypadku następuje przyleganie komórek do powierzchni naczyń użytych do ich hodowania (probówki, butle, szkiełka, płytki). Przyczepione komórki rozrastają się, tworząc z czasem jednolitą warstwę. Hodowla komórek w zawiesinie utrzymywana jest najczęściej za pomocą mieszadeł magnetycznych. W niektórych przypadkach stosuje się naczynia silikonowane w celu uniemożliwienia przyczepienia się komórek do powierzchni naczynia stosowanego do ich hodowli. Szczególnie zalecane jest stosowanie naczyń do jednorazowego użycia, zapewniają one bowiem właściwe warunki badań i są najbardziej ekonomiczne w stosowaniu. Do hodowli komórek oraz replikacji wirusa muszą być zapewnione w niektórych sytuacjach dodatkowe elementy technologiczne. Najczęściej jest to inkubacja hodowli komórkowej w atmosferze o podwyższonej i ściśle określonej zawartości C0₂, azotu oraz wilgotności.

Do hodowli komórek, a także wirusów w tych komórkach, muszą być stosowane odpowiednie płyny. Często płyny te mają odmienną zawartość, składników w zależności od tego, czy hoduje się same komórki, czy też wprowadzony zostaje wirus. Płyny odżywcze muszą być całkowicie jałowe. Obecnie większość płynów do hodowli komórek jest produkowana na skalę przemysłową. Jedynie specjalne podłoża do określonych celów są przygotowywane przez zainteresowane pracownie.

Stosowanie hodowli komórkowych, pochodzących od różnych zwierząt, człowieka, ptaków, zarodków itd., sprawiło, że opracowano ogromną liczbę najrozmaitszych receptur dla płynów odżywczych. Należy stosować takie, które są odpowiednie dla danego typu komórek (linii, klonu, szczepu komórkowego), kiedy następuje optymalny proces rozmnażania komórek.

Dodatek określonej surowicy ma istotne znaczenie (zwłaszcza dotyczy to surowicy cielęcej), a w niektórych sytuacjach jej dodanie w ściśle określoną ilości do płynu warunkuje możliwość hodowania określonych komórek. Na ogół przyjmuje się, że nieznaczny kilkuprocentowy dodatek surowicy (2-5%) pozwala na uzyskanie podłoża „podtrzymującego” wzrost komórek, natomiast zwiększenie zawartości surowicy (niekiedy nawet do 40%) stwarza podłoże „wzrostowe”. Określenia te wynikają z udowodnionego doświadczalnie korzystnego wpływu dodatku surowicy na wzrost komórki. Wypływa to z faktu, że podłoża odżywcze naśladują w dużym stopniu skład surowicy i płynów tkankowych, jakie otaczają komórki w warunkach in vivo. W niektórych sytuacjach zamiast surowicy stosuje się dodatek oczyszczonego białka z surowicy (najczęściej cielęcej).

W celu uchronienia hodowli przed zanieczyszczeniami bakteryjnymi dodaje się antybiotyki w stężeniu, w którym nie wywierają one niekorzystnego działania na rozmnażanie komórek oraz na podstawowe ich właściwości fizjologiczne, i których zachowanie determinuje ich wrażliwość na wirusa (w przypadku stosowania hodowli komórkowej do badania wirusologicznego). Surowice, a także inne dodawane do płynów odżywczych składniki krwiopochodne, mogą być źródłem zakażeń, w tym najbardziej uciążliwych nadkażeń mykoplazmami. Zakażenia takie najczęściej przenoszone są od ludzi pracujących przy przygotowywaniu podłoży, jak również przy zakładaniu hodowli komórkowych.

Ustalony skład płynów, produkowanych przez liczne wytwórnie na świecie, pozwala na ich standaryzaąę oraz standaryzację warunków, w jakich hoduje się komórki. Dodatek surowicy może jednak zachwiać ustalonymi wystandaryzo-wanymi warunkami hodowli (surowice pochodzą od różnych osobników). Stąd konieczność sprawdzenia każdej używanej surowicy na jej korzystną, wspomagającą wzrost komórek, aktywność oraz na obecność ewentualnych swoistych i nieswoistych inhibitorów replikaąi wirusa, co może rzutować na prawidłowość badań wirusologicznych. Ten ostatni aspekt skłania często do stosowania surowic inaktywowanych, kiedy wiele inhibitorów (termolabilne) ulega unie-czynnieniu. Jest to szczególnie istotne w przypadku zastosowania systemu komórkowego do celu diagnostycznego, który ma wykazać obecność lub brak wirusa w określonym materiale przekazanym do badania.

Metodą pozwalającą ua uzyskanie większej liczby komórek jest ich hodowanie w naczyniu o walcowatym kształcie, które wraz z komórkami umieszcza się w bębnie rotacyjnym. Obracający się z małą szybkością bęben pozwala na rozrost komórek na całej powierzchni butli. Liczba komórek jest wówczas wielokrotnie większa niż w hodowli statycznej.

Hodowle komórkowe mogą być pierwotne, pochodzące bezpośrednio z tkanek lub zarodków zwierzęcych albo ludzkich, mogą być też wtórne, ciągłe, ustabilizowane, pozwalające na prowadzenie licznych pasaży, często w sposób nieograniczony (linie komórkowe).

43