CIMG4144

METODY DIAGNOSTYCZNE

Klasyczne badanie wirusologiczne polega na uzyskaniu hodowli wirusa znajdującego się w materiale diagnostycznym, a następnie jego identyfikacji. W odległej już przeszłości stosowano do tego celu wyłącznie zwierzęta, co niezmiernie ograniczało i utrudniało możliwość diagnostyki wirusologicznej. Następnie do badań wprowadzono zalężone jaja ptasie (głównie kurze); obecnie stosuje się przede wszystkim hodowle komórek in vitro w postaci pierwotnych hodowli i linii ciągłych, wyprowadzonych z tkanek człowieka i zwierząt. Identyfikacja namnożonego w laboratorium wirusa jest wykonywana na ogół metodami serologicznymi.

Wartość dowodowa tego typu dodatniego badania wirusologicznego (izolacja i identyfikacja wirusa) może być bardzo duża, zwłaszcza wówczas, gdy rodzaj badanego materiału w warunkach zdrowia jest jałowy (krew, płyn mózgowo-rdzeniowy) lub pochodzi z miejsc zmienionych chorobowo (np. z zajętych błon śluzowych, zmian skórnych, zmian w narządach rodnych). Wartość diagnostyczna takiego badania może być natomiast problematyczna w przypadkach próbek kału lub popłuczyn z gardła, gdyż wykryty w takim materiale wirus może nie być czynnikiem etiologicznym diagnozowanej choroby, lecz wirusem przypadkowo nadkażającym badany organizm. Badanie takie nabiera jednak istotnej wartości dowodowej w sytuacjach ognisk epidemicznych, kiedy izolacje wirusów uzyskuje się od co najmniej kilku chorych (np. wirus grypy, enterowirusy).

Wadą wymienionych wirusologicznych badań diagnostycznych jest ich długotrwałość - wiele dni, a nawet tygodni potrzeba do namnożenia i identyfikacji - a także stosunkowo wysoki koszt.

Dlatego coraz szerzej i z dużym powodzeniem stosuje się metody pozwalające na stwierdzenie obecności wirusa lub jego składników strukturalnych bezpośrednio w oryginalnym materiale diagnostycznym. Metody te mogą być szczególnie zalecane w przyszpitalnych laboratoriach diagnostycznych, a powinny być w powszechnym zastosowaniu we wszystkich pracowniach wirusologicznych. Polecane są metody immunofluorescencyjne (pośrednia i bezpośrednia), immunoenzymatyczne (ELISA) oraz metody biologii molekularnej. Pozwalają one na uzyskanie wyniku w ciągu kilku godzin od pobrania materiału. Natomiast ze względu na wysoki koszt aparatury i jej utrzymania metody mikroskopowo-elektronowe i radioimmunologiczne mają bardziej ograniczone zastosowanie.

Dodatni wynik wirusologicznych badań diagnostycznych potwierdza więc rozpoznanie lub podejrzenie klinicysty. Natomiast ujemny wynik ma mniejszą wartość dowodową, gdyż może być np. następstwem niedoskonałości pobierania materiału i jego przechowywania lub pobrania go w nieodpowiednim czasie.

Wykazanie obecności wirusa, antygenu lub kwasu nukleinowego wirusa w materiale diagnostycznym świadczy o zakażeniu, natomiast etiologiczny związek między stwierdzonym wirusem a zmianami chorobowymi może być wykazany jedynie przez porównanie objawów klinicznych i informacji epidemiologicznych z wynikiem badania wirusologicznego, z uwzględnieniem rodzaju badanego materiału.

Uwagi te są przykładowe, lecz oznaczają, że ostateczna diagnoza należy do lekarza klinicysty, oraz że zasadnicze znaczenie ma wczesna i szybka laboratoryjna diagnostyka wirusologiczna, wykonana na właściwym i właściwie dostarczonym materiale diagnostycznym.

Inny kierunek diagnostyczny wykorzystuje właściwości immunogenne wirusów, a właściwie następstwa tego działania na organizm. Szczególnie diagnostycznie istotne są humoralne odpowiedzi organizmu na antygeny wirusowe. Badania polegają na wykryciu i identyfikacji swoistych przeciwciał dla wirusa oraz ustaleniu ich stężenia (miano przeciwciał).

Klasyczne diagnostyczne badania serologiczne, niezależni*; od użytej techniki i typu wykrywanego przeciwciała, a stosowane w zasadzie we wszystkich ostrych zakażeniach wirusowych (często też w postaciach nawrotowych i przewlekłych), wymaga pobrania co najmniej dwóch próbek materiału diagnostycznego. Powinny one być pobrane w odstępie czasu pozwalającym na uchwycenie znamiennego (co najmniej 4-krotnego) przyrostu miana przeciwciał. Pierwsza próbka powinna być zatem pobrana natychmiast, jak tylko to jest możliwe, po zgłoszeniu się chorego, a więc w ostrej fazie choroby, kiedy są dopiero uruchamiane mechanizmy immunologiczne związane z aktualnym czynnikiem zakażającym. Bada się najczęściej surowicę krwi, w szczególnych przypadkach (zajęcie ośrodkowego układu nerwowego) również płyn mózgowo-rdzeniowy. Inne materiały (popłuczyny z gardła, płyny wysiękowe, siara) bada się niezmiernie rzadko, częściej w celach naukowych.

Dodatni wynik badania serologicznego (znamienny przyrost miana przeciwciał) stanowi jednoznaczne potwierdzenie określonego zakażenia wirusowego. Sporadyczne trudności interpretacyjne mogą wynikać z ewentualnych pokrewieństw antygenowych między niektórymi typami wirusów, reakcji anamnes-tyęznych, działania nieswoistych inhibitorów reakcji serologicznej. Można je wyjaśnić, chociaż niezbędne są dodatkowe oznaczenia. Zasadniczą wadą tego kierunku diagnostycznego jest konieczność pobrania drugiej próbki surowicy, co najmniej po kilku dniach - zalecane jest pobranie drugiej próbki nie wcześniej niż po upływie 10-14 dni.

Dążono zatem do opracowania metod, które skracałyby samą procedurę badania serologicznego i pozwalały na ustalenie rozpoznania na podstawie badania jednej próbki materiału diagnostycznego. Wykorzystując specyfikę odpowiedzi immunologicznych w licznych zakażeniach wirusowych, opracowano metody identyfikacji przeciwciał przeciwwirusowych w klasach immuno-globulin, ze szczególnym uwzględnieniem IgM. Kierunek ten jest np. przydatny do diagnostyki zakażeń wirusowych u kobiet ciężarnych (zakażenia płodu) i u noworodków takimi wirusami, jak wirusy różyczki, cytomegalii, herpes simplex oraz zakażeń ośrodkowego układu nerwowego wirusami odry, nagminnego zapalenia ślinianek przyusznych, niektórymi arbo wirusami. Do tych celów powszechne zastosowanie znajdują również techniki immunofluorescencyjne i immunoenzymatyczne, a także radioimmunologiczne (problemy bezpieczeństwa pracy i koszt aparatury).

Podstawowym materiałem do diagnostycznych badań wirusologicznych jest materiał pochodzący od chorego. Nie jest to jednak jedyne zastosowanie tych metod. Są one przydatne również do diagnozowania materiału pobranego od osób z otoczenia chorego, pozwalając na prognozowanie ewentualnych dal-

153