CIMG4146

Przygotowany materiał diagnostyczny można wprowadzić do trzech systemów (w zależności od tego, w kierunku jakich wirusów badanie będzie wykonywane): zwierzęta, zarodki kurze, hodowle komórkowe (p. również rozdz. poświęcony biologicznej aktywności wirusów).

Zwierzęta zakaża się rozmaitymi drogami: domózgowo, donosowo, podskórnie, śród skórnie, domięśniowo, dootrzewnowo, przez krew, czasami do-rdzeniowo, ewentualnie do określonego narządu (wątroba, płuca, tchawica). Najczęściej stosowanymi zwierzętami są myszy, szczury, świnki morskie, króliki, kury, egasami małpy i fretki oraz psy i koty. Dobór zwierzęcia i drogi podania materiału zależą od tego, jakiego wirusa oczekujemy w badanym substrade.

Istotną rolę w diagnostyce wirusologicznej spełnia zarodek kurzy. Używa się na ogół 7-13-dniowe zarodki kurze. Materiał wprowadza się na błonę chorio-alantoidalną, wprost do zarodka, do przestrzeni owodniowych i omoczniowych tub do woreczka żółtkowego.

Szczególną rolę w diagnostyce wirusologicznej odgrywają jednak badania in vitro w określonych hodowlach komórkowych i tkankowych. Do pewnych celów stosuje się również hodowle narządowe, jednak nie weszły one do szerokiej rutynowej praktyki diagnostycznej ze względu na wymagania metodyczne dostępne jedynie dla niektórych pracowni. Aczkolwiek w przypadku badań nad udziałem wirusów w onkogenezie obserwuje się nawrót do atrakcyjnych metod hodowli organowych, zachowujących klasyczną więź komórek odzwierciedlających zależności in vivo.

Stosowane są głównie linie ciągłe określonych komórek, w mniejszym stopniu pierwotne hodowle komórkowe. Hodowle pierwotne są przygotowywane każdorazowo, jak hodowle komórek nerek małp, świń lub chomików oraz zarodków kurzych. Hodowle Bnii ciągłych pochodzą z rozmaitych narządów i gatunków zwierzęcych i mogą być używane w ograniczonej liczbie pasaży (hodowle komórek diploidalnych) lub nieograniczonej (hodowle linii hetero-płoićalnych).

Wprowadzenie materiału badanego zawierającego wirusa odpowiednim zwierzętom oraz do zarodków i hodowli komórkowych prowadzi do wystąpienia określonych zmian. W przypadku zwierząt doświadczalnych dochodzi do ich padania tub rozwinięcia określonych objawów (np. porażenia), na ogół poprzedzających śmierć zwierzęcia. Wykonuje się wówczas dodatkowe oznaczenia: przydatna jest metoda immunofluorescencji, pozwalająca na umiejscowienie wirusa lub jego antygenów w komórkach różnych narządów zakażonych zwierząt; przeniesienie do hodowli in vitro pozwala na dalsze postępowanie laboratoryjne w kontrolowanych warunkach in vitro\ możliwe jest także zastosowanie metod molekularnych zarówno do badania próbek tkanek zwierzęcych, jak i wtórnie zakażonych hodowli komórkowych.

Zwierzęta laboratoryjne stosowane są głównie do diagnostyki zakażeń takimi wirusami, jak Coxsackie (głównie grupy A), arbowirusami (np. kleszczowego zapalenia mózgu), wirusem wścieklizny, wirusem Herpes simplex.

Zarodek kurzy okazał się bardzo przydatny do izolacji licznych wirusów: orto- i paramyksowirusów, pokswirusów (ospa, krowi anka, ospa krowia, ek-tromelia), wirusów herpes, końskiego zapalenia mózgu, mięsaka Rousa. Zakażone zarodki obumierają lub na ich błonach płodowych powstają charaktery-

styczne zmiany. W innych przypadkach dochodzi do replikacji wirusa bez pqważniejszych widocznych zmian, natomiast jego obecność można stwierdzić np. metodą hemaglutynacji wirusowej lub metodą immunofluorescencji, lub wtórnie zakażając treścią zarodków wrażliwe hodowle komórkowe lub wrażliwe zwierzęta.

Materiał diagnostyczny wprowadzony do hodowli komórkowych, w zależności od obecnego w nim wirusa, prowadzi do rozwoju określonych zmian cytopaiologicznych (efekt cytopatyczny). Zmiany te są zróżnicowane i występują pod wpływem rozmaitych i licznych typów wirusów należących do enle-rowirusów i rinowirusów, licznych arbowirusów, wirusów herpes, adenowirusów, pokswirusów itd. Wirusy te wywołują określone zmiany cytopatyczne widoczne w bezpośredniej obserwacji mikroskopowej bądź po barwieniu zakażonych komórek. Przy ich braku można wykazać obecność wirusa w hodowli komórkowej metodami dodatkowymi — za pomocą interferencji (np. wirusa różyczki w pierwotnej hodowli komórek nerki małpiej nadkażonej np. wirusem ECHO typu 11), hem adsorpcji (obecność wirusa parainfluenzy) oraz pośrednią lub bezpośrednią metodą immunofluorescencji (liczne wirusy — różyczka, myksowirusy itp.), wreszcie metodami molekularnymi ujawniającymi obecność wirusowego kwasu nukleinowego, co jest szczególnie przydatne w badaniu zakażeń bez jednoznacznego efektu cytopatycznego.

Jak wielokrotnie już wykazano, replikacja wirusa w komórkach jest związana z wieloma czynnikami warunkującymi zapoczątkowanie zakażenia i jego dalszy przebieg. Niejako kluczowymi elementami są następujące czynniki niezbędne dla wystąpienia replikacji różnych wirusów: obecność receptorów, enzymów odpłasz-czających, transkryptaz, kinaz, proteaz, translacji, a więc odtwarzania składników potomnej generacji. Znając pasma replikacji charakterystyczne dla danego wirusa, można ustalić postępowanie zapewniające wyłącznie określonemu wirusowi zakażenie komórki i optymalne warunki replikacji. W ten sposób można stworzyć korzystny system wykrycia wirusa (enzym-linked virus inducible system). Takie systemy komórek mogą mieć zastosowanie do izolacji nieznacznych zawartości wirusów, uzyskiwania wysokich mian do badań molekularnych, genetycznych. Niejako odwrotnością tej sytuacji byłoby uzyskiwanie linii opornych. Posługując się zwierzętami transgenicznymi, zachodzi możliwość uzyskania również pierwotnych transgenicznych hodowli komórek.

Ponadto izolację wirusów można uzyskać, stosując hodowle narządowe, stanowiące wycinki i fragmenty tkanek lub metody współhodowli (cocultiva-tion) różnych komórek. Oba jednak systemy nie mają powszechnego zastosowania diagnostycznego, lecz służą raczej do ściśle określonych celów badawczych, chociaż przyczyniły się do wielu istotnych osiągnięć (izolacje i różnicowanie rinowirusów, pokswirusów, retrowirusów).

DIAGNOSTYKA MIKROSKOPOWA

Mikroskopowe metody diagnostyczne można uszeregować w zależności od stosowanego sprzętu mikroskopowego następująco: oparte na badaniu w mikroskopie świetlnym, w mikroskopie elektronowym oraz w mikroskopie fluorescencyjnym.

157