cwiczenie@003

Metody bezpośrednie

AKADEMIA D i. ;Si I C Z A

* -kolei itr 3

v^v-t Metoda biuretowar ^v*tv

i r, ci -f-OLOi •    .

Katedra TowarozRa‘.v-*v.

Metoda biuretowa polega na oznaczaniu białek ^peptydow'zawierających co najmniej dwa wiązania peptydowe, które tworzą w środowisku alkalicznym barwne kompleksy z jonami miedzi. Intensywność powstałego fiołkowego zabarwienia jest proporcjonalna do stężenia białka. Przez pomiar wartości absorpcji powstałego zabarwienia roztworu przy długości fali 540 nm oznacza się zawartość białka w roztworze. Metoda ta pozwala na oznaczenie zawartości białka w próbie zawierającej do 4% białka.

Odczynniki. 1. Odczynnik biuretowy: w kolbie miarowej o poj. I dm^J rozpuścić w ok. 500 cm³ wody destylowanej 1,5 g siarczanu (VI) miedzi (II) CuS0₄'5H₂0, 6,9 g winianu sodu i potasu NaKC₄M₄0₆ 4H₂0, dodawać wolno 300 cm³ 10-proccntowcgo roztworu wodorotlenku sodu i 2 g jodku potasu i uzupełnić do kreski wodą destylowaną: przechowywać w butelce z ciemnego szkła. 2. Wzorcowy 1-procentowy roztwór białka: w kolbie miarowej o poj. 100 cm³ rozpuścić w 50 cm³ 0,9-procentowcgo roztworu chlorku sodu 1 g preparatu albuminy wołowej i uzupełnić do kreski 0,9-proccntowym roztworem chlorku sodu.    ^;

* Wykonanie oznaczenia. Sporządzenie krzywej standardowej. Do pięciu probówek pobrać kolejno: 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 i 1 cm³ roztworu wzorcowego. Pierwsze cztery probówki uzupełnić do objętości I cm³ 0,9-procentowym roztworem chlorku sodu, a następnie do każdej probówki dodać po 4 cm³ odczynnika biuretowego, dokładnie wymieszać i pozostawić w temperaturze pokojowej na 30 min. Zmierzyć wartość absorpcji prób przy długości fali X = 540 nm. Próbą odniesienia jest próba przygotowana w identyczny sposób, lecz zawierająca zamiast białka 0,9-proccntowy. roztwór chlorku sodu.

Wykreślić krzywą standardową (wzorcową), odkładając na osi rzędnych wartość absorpcji, a na osi odciętych — zawartość białka w g na 100 cm³.

Oznaczenie w badanej próbce. Odmierzyć pipetą do probówki 1 cm³ badanego roztworu białka (jeśli próbka zawiera stężenie białka wyższe niż 1%, należy próbkę rozcieńczyć), dodać 4 cm³ odczynnika biuretowego i postępować dalej tak jak przy próbkach wzorcowych. Zawartość białka odczytać z krzywej standardowej (wzorcowej).

-0 -