h (157)

26. RNAm protection liny:

Obejmuje uzyskanie sondy antysensownej, która powstaje w reakcji transkrypcji In vltro na bazie sklonowanego fragmentu ONA, który otoczony jest przez odpowiednie promotory fagowe. Otrzymane sondy są w roztworze hybrydyzowane z preparatem RNA badanych. Hybrydy są następnie obtrawlane RNAzą trzustkową I tylko perfekcyjnie dopasowane rejony pomiędzy sondą a badanym RNA przetrwają trawienie. Żeby metoda pracowała w sposób Ilościowy trzeba do hybrydyzacji zastosować nadmiar sondy (tak by wysycać całą możliwą pulę docelowych cząsteczek). Zaletami tej metody są: wysoka czułość - ale nie aż taka jak RT-PCR, hybrydyzacja w roztworze zachodzi wydajniej niż na błonach, mniejsze niż w Northern wymagania co do jakości preparatu, wygodne Jest analizowanie wielu docelowych cząsteczek RNA Jednocześnie - w przeciwieństwie do Northern - na jednym żelu można analizować ekspresję różnych genów poprzez zastosowanie różnych sond. Wady: tracimy Informacje o wielkości transkryptu, gdyż jego końcowe rejony oraz sondy są obtrawlane działaniem nukleolltycznym, wymagana jest bezwzględna homologla pomiędzy sondą I docelową cząsteczką.

30. Przy konstrukcji bibliotek oonomowych:

a)    stosujemy elektroforezę pułsową (1)

b)    duła pojemność wektora zmniejsza szanse na znalezienie docelowej sekwencji (1)

c)    bazuje na llgacjl (1)

d)    stosuje się fragmenty restrykcyjne genomowego DNA (1)

Metoda postępujących (jednokierunkowych) delecjl wykorzystuje:

a)    Jeden starter (uniwersalny), który jest zakotwiczony w obrębie sekwencji wektora (1)

b)    trawienie egzonukleazą III (1)

c)    mołna użyć do badania długich fragmentów (1) (Jest to jedna ze strategii sekwencjonowanla DNA. Jeżeli sekwencjonujemy DNA metodą dideoksypochodnych to w zależności od wariantu tej techniki możemy przeczytać od kilkuset do 1,5 tysiąca nukleotydów w czasie jednego przebiegu sekwencjonowanla.)

d)    stosujemy 2 enzymy: pierwszy trawi w pobliżu insertu i generuje końce lepkie 5' albo tępe, a drugi lały w oddaleniu od pierwszego I generuje lepkie końce 3' (1)

Pollmersza Taq, jej aktywność 5' - 3'

a)    nie występuje (O) (ma aktywność pollmerazy 5'-3' oraz egzonukleazy 5'-3' ale bardzo słabą)

b)    wykorzystywana do TaąMan (I) (jej aktywność egzonukleazy 5-3'Jest wykorzystywana w technice real time PCR z wykorzystaniem sondy TaąMan)

c)    sprawia ze jest dokładna (1) (frekwencja błędów wynosi 2,2*I0’⁵ na nukleotyd na cykl)

d)    produkty mają tępa końca (O) (produkuje mlkrolepkle końce adenlnowe na końcu 3' co ma znaczenie przy klonowaniu)

Polimeraza Taq najlepiej pracuje w przedziale temperatur 75-80°C. Stosuje się ją do: ampllflkacjl DNA (PCR), znakowania DNA radioizotopami, dlgoksygenlną I blotyną, sekwencjonowanie DNA.

Biblioteki chromosom jumping:

a)    powstają przez trawienie enzymem często tnącym, llgacją z markerem I trawienie enzymem rzadko tnącym (O) (tak powstają biblioteki typu llnking natomiast biblioteki jumping na odwrót tzn. enzym rzadko tnący, llgacja z markerem, enzym gęsto tnący)

b)    w technice chromosome Jumping zawsze występują z bibliotekami typu Unklng (1)

c)    służą do przenoszenia między odległymi końcami fragmentów restrykcyjnych (1) (wędrówka po chromosomie techniką skakania jest bardziej wydajna - szybciej pokonuje się odległości fizyczne, genomowi)

d)    pomagają ominąć niemożliwe do sekwencjonowanla fragmenty biblioteki (1)

Ampllflkacja RNA:

a)    RT-PCR (1)

b)    raal-tlma RT-PCR (O)

c)    TAIŁ- PCR (O)

d)    RACE - PCR (1)