img147

odczynnika 2 do precypitatu. Przenieść do chłodni i mieszać za pomocą mieszadła elektromagnetycznego 15 min, po czym odwirować (2500 obr./min, w temp. 4°C przez 15 min). Następnie rozpuścić osad w 275 ml odczynnika 3 w temperaturze pokojowej. Odwirować część nierozpuszczalną (2500 obr./min w temp. 4°C przez 15 min) i usunąć osad. Do supernatantu (temp. 4°C) dodać 49 ml zimnego odczynnika 4. Mieszając ciecz pozostawić w temp. 4°C na 15 min. Całość odwirować (2500 obr./min w temp. 4°C przez 15 min). Mieszając dodać do supernatantu 140 ml zimnego odczynnika 5. Mieszaninę ochłodzić do — 3°C i pozostawić w tej temperaturze na 15 min. Ponownie odwirować całość (2500 obr./min w temp. — 3°C przez 15 min). Osad rozpuścić w 1000 ml odczynnika 6 (w temp. 4°C ok. 12 godz.) używając mieszadła magnetycznego. Części nierozpuszczalne odwirować (2500 obr./min w temp. 4°C przez 15 min). Do supernatantu dodać kroplami 351 ml zimnego nasyconego roztworu (NH₄)₂S0₄ do 26% nasycenia i po zakończeniu tej czynności mieszać jeszcze 1 godz. Dalej całość odwirować (3500 obr./min w temp. 4°C przez 30 min). Osad rozpuścić w małej objętości (ok. 60 ml) odczynnika 6. Mieszaninę dializować w temp. 4°C wobec tegoż odczynnika, najmniej 12 godzin. Nierozpuszczalne części usunąć za pomocą wirowania (wirówka K-24, 4000 obr./min w temp. 4°C przez 20 min). Oznaczyć spektro-fotometrycznie stężenie otrzymanego roztworu fibrynogenu (współczynnik absorpcji A 2gonm = 15,5) oraz stopień jego krzepliwości (ćw. 12.55). Wyliczyć wydajność preparatyki fibrynogenu. Roztwór przechowywać w temp. — 20°C.

Ćwiczenie 12.53. Izolowanie fibrynogenu metodą Blombacka (B. Blomback, M. Blom-back 1956: Ark iv.Kenii., 10:415-419)

Zasada: Z osocza wytrąca się za pomocą 8% etanolu (v/v) tzw. I frakcję Cohna, którą następnie oczyszcza się mieszaniną cytynianowo-etanolowo-glicynową o tak dobranych stężeniach, by sprzyjały rozpuszczaniu się wszystkich składników białkowych z wyjątkiem fibrynogenu.

Materiał: Cytrynianowe osocze świni lub wołu.

Odczynniki:

1)    Bufor octanowy (pH 4,0): Do 82 ml 0,8 M roztworu octanu sodowego (16,41 g CH₃COONa rozpuścić i uzupełnić wodą do 250 ml) należy dodać 28 ml CH₃COOH lodowatego rozcieńczonego 2-krotnie wodą.

2)    57,3% roztwór etanolu: Do 57,3 ml absolutnego etanolu dodać 54,5 ml H₂0. Przed użyciem etanol należy oziębić w zamrażarce.

3)    0,055 M roztwór cytrynianu sodowego o pH 7,2. Rozpuścić 16,177 g C₆H₅0₇Na₃ 2H₂0 i uzupełnić wodą do 1000 ml, pH doprowadzić za pomocą 1 M roztworu HC1.

4)    0,055 M bufor cytrynianowy - 6,5% etanol - 1 M glicyna o pH 6,0. Rozpuścić 16,177 g C₆H₅0₇Na₃ • 2H₂0 i 75 g glicyny w ok. 800 ml H₂0, dodać 65 ml absolutnego etanolu, doprowadzić do pH 6,0 za pomocą stęż. HC1 i uzupełnić wodą do 1000 ml.

5)    0,055 M bufor cytrynianowy - 6,5% etanol - 1 M glicyna (pH 7,2).

Wykonanie: Osocze doprowadzić do pH 7,2 za pomocą buforu octanowego i oziębić w łaźni z lodem do temp. 0°C. Następnie dodać do osocza kroplami (stale mieszając) wychłodzony etanol do końcowego stężenia 8% (177 ml 53,3% etanolu na 1000 ml osocza). W czasie dodawania etanolu obniżyć stopniowo temperaturę do — 3°C. Osocze pozostawić w tej temperaturze przez 30-60 minut, z łagodnym mieszaniem.

Strąt (frakcję I Cohna) oddzielić przez wirowanie (wirówka K-70, 2500 obr./min w temp. — 3°C przez 20 min). Uzyskuje się 30-40 g osadu z 1 litra osocza. Frakcja ta zawiera 40-50% białka wykrzepianego trombiną. Dalsze oczyszczanie polega na 2-krotnym ekstrahowaniu osadu buforem cytrynianowym z etanolem i glicyną. Ekstrakcja 1: Do osadu dodać 700 ml zimnego odczynnika 4. Uzyskaną zawiesinę mieszać w temp. — 3°C przez 1 godz., po czym odwirować (2500 obr./min w temp. — 3°C przez 20 min). Supernatant odrzucić.

Ekstrakcja 2: Wykonać jak wyżej, lecz używając zimnego odczynnika 5.

Osad rozpuścić w małej objętości (ok. 60 ml) 0,055 M roztworu cytrynianu sodowego (pH 7,2). Mieszaninę dializować wobec tegoż odczynnika najmniej 12 godz. Nierozpuszczalne części usunąć za pomocą wirowania (wirówka K-24, 4000 obr./min, 20 min). Oznaczyć spektrofotometrycznie stężenie otrzymanego roztworu fibrynogenu (używając współczynnika absorpcji A ^l2%'₀ nm = 15,5) oraz stopień jego krzepliwości (ćw. 12.55). Roztwór białka przechowywać w temp. — 20°C.

Ćwiczenie 12.54. Izolowanie Fibrynogenu metodą chromatografii powinowactwa

(D.L. Heene, F.R. Matthias 1979: Tliromb.    41:677-686; zmodyfikowane)

Zasada: Fibrynogen świni, otrzymany metodą Doolittle’a, wiązany jest kowalencyjnie za pomocą wolnych grup aminowych z żelem CNBr-Sepharose, a następnie przekształcany z udziałem trombiny do monomerów fibryny (odsłonięcie N-końcowych miejsc polimeryzacyjnych). Uzyskane w ten sposób złoże [Fibrin(Fb)-Sepharose 4B] wykazuje powinowactwo zarówno do fibrynogenu rodzimego, jak i innego pochodzenia. Metoda ta służy do bezpośredniego izolowania białka krzepliwego z małych próbek osocza bądź niektórych produktów jego plazminowej degradacji, np. fragmentów X, Y i D.

Odczynniki:

1)    CNBr-Sepharose 4B (5g).

2)    Roztwór fibrynogenu o stężeniu 10-15 mg/ml w 0,1 M buforze boranowym o pH 8,3 (20-30 ml).

3)    Roztwór trombiny (8 j.NIH/ml w soli fizjologicznej).

4)    1 mM roztwór HC1 (1000 ml).

5)    PBS: 0,01 M bufor fosforanowy - 0.14 M NaCl (pH 7.4).

6) 0,1 M bufor boranowy o pH 8,3. A. Rozpuścić 12,404 g H₃B0₄ oraz 2/892 g NaCl i uzupełnić wodą do 1000 ml. B Rozpuścić 19,108 g Na₂B₄0₇ • 10H₂O i uzupełnić wodą do 1000 ml. Zmieszać 4 objętości A z 5 objętościami B w celu uzyskania pH 8.3.

7)    0,1 M bufor octanowy o pH 4,0. Rozpuścić 5,85 g NaCl oraz 0.82 g CH₃COONa w ok. 90 ml H₂0, doprowadzić pH za pomocą CH₃COOH lodowatego i uzupełnić wodą do 100 ml.

8)    0,01 M NaH₂P0₄ - 1 M NaCl (pH 4,1).

9)    0,01 M NaH₂P0₄ - 1 M NaCl - 6 M mocznik (pH 4,1).

Uwaga: pH roztworów 8 i 9 doprowadzić stężonym H₃P0₄.

Wykonanie:

1. Wiązanie fibrynogenu do złoża. Odważyć 5 g CNBr-Sepharose 4B, wsypać do 100 ml 1 mM roztworu HC1 i pozostawić na okres 15 min do napęcznienia. Otrzymany żel przemyć 5-krotnie pozostałą ilością (900 ml) 1 mM roztworu HC1, a następnie 2-krotnie buforem boranowym o pH 8,3. Do gęstej zawiesiny (ok. 20-25 ml) dodać 20 ml roztworu fibrynogenu o znanym stężeniu. Sprawdzić pH mieszaniny (powinno wynosić powyżej 8,0). Całość, delikatnie mieszając, pozostawić w temp. 4°C

647