3582326757

Wykład 5 16.03

Peroksydaza me jest siibstratem, to białko. Zatem jak połączyć to białko z DNA? - Poprzez reakcję sieciowania aldehydem glutaiowym. W ten sposób powstaje sonda, zaznakowana peroksydazą, która specyficznie wiąże się z DNA kłomi.

Jak przeprowadzić detekcję? Jak-wykryć te miejsca, w któiych peroksydaza jest zlokalizowana?

Wykorzystuje się zjawisko chemiluminescencji. Polega ona na tym, iż podczas reakcji chemicznej emitowana jest energia w postaci świetlnej. Substratem dla peroksydazy jest luminol.

Przykłady teclinik hybrydyzacyjnych do poszukiwania klonów

Znakowanie peroksydazą chrzanową

• Poszukiwanie cDNA klonu, któiy reprezentuje transkiypt, występujący w komórkach w dużym nadmiarze. Transkiypt występuje w specjalnym klonie, któiy jest nadreprezetowany.

Np. komórki produkujące insulinę lub gliadyna

Cel: znalezienie klonu któiy zawiera transkiypt w dużych ilościach

•    Wybrano pizypadkowy klon wyizolowano DNA.

•    Po wycięciu inseitu otrzymano sondę, któią wykorzystano do przeszukiwania biblioteki klonów.

Wynik: Sonda została związana specyficznie tylko w jednym miejscu, tam skąd pobrano DNA. Trafiono na klon któiy nie jest nadreprezentowany. Ścieżka ślepa.

Próba B: Wybrano kolejny przypadkowy klon. Odtworzono procesy.

Wynik: Po hybrydyzacji pojawia się wiele klonów. Oznacza to, że trafiono na klon, któiy jest obecny w wielu klonach innych. Mamy do czynienia z nadiepre-zentowanym DNA.

•    znalezienie klonu gdy nie dysponuj emy informacją DNA ani RN A, ale posiadamy produkt białkowy.

Dla danego produktu białkowego można odtworzyć DNA znając układ aminokwasów

•    najlepiej wybrać taką sekwencję aminokwasową, której będzie odpowiadało najmniej kodonów. (np. Met - 1 kodom Tip - 1 koclon)

Sonda musi być jak najbardziej zdegenerowana. tak by zawierała jak najmniej różnych sekwencji.

Sonda jest znakowana przy pomocy kinazy P4. Następuje przeszukanie biblioteki -Ale czy jest to wiązanie specyficzne?

Syntetyczne oligonukleotydy znakowane na końcach

Biblioteka DNA drożdżowego

Oligonukleotydy hybrydyzują z odpowiednimi fragmentami klonu

Autoradiografia

Biblioteka klonów

Sonda A    Sonda B

duże ilości transkryptu

Otrzymujemy trzy klasy (dwa sygnały słabe, trzeci mocny). Trzeci może być specyficzny. Zatem wrócono do sekwencji białka odnaleziono inną, również zde-generowaną. Powtórzono doświadczenie z inną sondą. Jeśli wynik znów pokaże ten sam klon. duża szansa, że klon zawiera szukaną przez nas sekwencję.

•    W różnych gatunkach wykorzystywane są różne lcodony. Istnieją tablice podające informacje na ten temat. Dzeki temu można lepiej przewidywać sekwencje nukleotydów.

•    Hybrydyzacja heterologjczna pomędzy gatunkami polega na tym iż tą samą sondąprzeszukujemy biblioteki klonów iiuiych gatunków, by uzyskać informacje, jak podobne są poszczególne geny względem siebie.