3582327190

TRAWIENIE WEKTORA, ENZYMY RESTRYKCYJNE

1.    enzymy restrykcyje (jak działają, czego potrzebują do swojej aktywności, definicja jednostki aktywności, warunki przechowywania i ich konsekwencje, aktywność gwiezdna, jak zatrzymać reakcje trawienia)*

2.    metylacja DNA i jej konsekwencje

3.    izoschozomery

4.    neoschizomery

5.    izokaudamery

6.    paiindrom

7.    cechy dobrych wektorów ekspresyjnych (przypomnieć sobie dyskusje na temat zadania 8 z listy 2 z BM)

8. końce lepkie, tępe, kohezyjne, komplementarne, kompatybilne

9.    fosfatazy

10.    supersknęcony DNA

Enzymy restrykcyjne do swojej aktywności wymagają:

-kationu dwuwartościowego

-buforu (TrisxCl) dla utrzymania optymalnego pH

-odczynniki Holowe mogą być użyteczne dla stabilizacji enzymu a także potencjalnych zanieczyszczeń

-niektóre er są bardzo wrażliwe na stężenie jonów sodowych lub potasowych (siła jonowa-im wyższa, tym słabsze oddziaływania elektrostatyczne)

Zatrzymywanie reakcji trawienia:

-dodanie EDTA, który chelatuje jony Mg2+

-ekstrakcja (fenol/chłoroform) - inaktywacja białek w próbce, DNA zostaje w fazie wodnej, na granicy faz= zdenaturowane białko. nieodwracalne metody inaktywacji enzymu oraz usuwanie

-wytrącanie w etanolu    wszystkich cz. er

-inaktywacja pod wpływem temperatury-inkubacja w 65C przez 20 min. (żeby nie dopuścić do wzrostu bakterii)-niektóre pozostaję aktywne w 65C ale tracą swoją zdolność do cięcia w wyższej temperaturze, enzymy termofilne, których optimum zawiera się w 50-55C mogą być inaktywowane-80C przez 20 min.

Bufor do ER:

-    MgCI (Mg 2+ potrzebne do aktywności enzymu) , NaCl/KCl

-    TrisxCI - optymalne pH dla funkcjonowania enzymu

-    2-merkaptoetanol (2-ME) lub DTT ditiotneitol - użyteczne przy stabilizacji niektórych ER lub mogą stabilizować potencjalne zanieczyszczenia

-    B5A - używane jako nośnik i stabilizator białka w trawieniu enzymem restrykcyjnym; odmiareczkowuje zanieczyszczenia i imituje "warunki naturalne" - bo białko lubi towarzystwo innych białek, dodatkowo BSA jest białkiem inertnym tzn. jest w układzie, ale nie oddziałuje z nim.