25688

- Pomiary wykonywane są jednakże przy pH około 4,5 (w granicach 3-5), ponieważ przy takim pH intensywność fluorescencji jest stosunkowo stała i niezależna od szeregu czynników interferujących, tj stężenia soli czy cukrów, obecności jonów żelaza itp.

•    Natężenie fluorescencji jest wprost proporcjonalne do stężenia witaminy w badanym roztworze

•    Odczytu fluorescencji można dokonywać z krzywej wzorcowej lub przy użyciu standardu wewnętrznego, tzn stosując dodatek czystej ryboflawiny dodanej w ściśle określonej ilości do próbki równoległej do badanej

•    Istotne znaczenie w tej metodzie ma stopień oczyszczenia próbki

Oznaczenie przebiega w trzech etapach:

1.    Ekstrakcja witaminy - ma na celu uwolnienie witaminy z połączeń białkowych i fosforanowych przez zastosowanie hydrolizy kwasowej i enzymatycznej

2.    Utlenienie substancji interferujących, stosowane w celu usunięcia innych substancji fluoryzujących i interferujących

3.    Pomiar fluorymetryczny - wykonywany jest przed i po chemicznej redukcji ryboflawiny tak, aby z różnicy tych wartości określić faktyczne stężenie witaminy w roztworze

METODA LUMIFLAWINOWA

• Polega na przeprowadzeniu nierozpuszczalnej w chloroformie ryboflawiny pod wpływem naświetlenia (fotoliza) w środowisku zasadowym w rozpuszczalną w chloroformie lumiflawinę

Ryboflawina -> UV, pH>7 -Humiflawina

•    Przemiana ta może jednak nie zachodzić ilościowo, dlatego też konieczne jest stosowanie idealnie powtarzalnych warunków pracy

•    Powstały po zakwaszeniu związek można zmierzyć fluorymetrycznie (niebieska fluorescencja)

METODA PRZY UŻYCIU TECHNIKI HPLC

Polega na wstępnym uwolnieniu ryboflawiny z połączeńm białkowych i fosforanowych, a następnie jej ilościowym oznaczeniu przy użyciu HPLC w układzie faz odwróconych z detektorem fluorymetrycznym

WITAMINA C