101948

Znaczniki- P^K, S^K, H³, C¹⁴ emitują określony typ promieniowania co pozwala na ich uwidocznienie na kliszach (tj miejsc, do któtych się przyłączyły).

Detekcja oparta na autoradiografii (zastosowanie filmów wrażliwych na promieniowanie).

Możliwe wbudowywaie znakowanych nukleotydów na całej długości sony (met Nick-translation) lub na jej końcach (5’- przez KP lub 3’- pizez polDNA fragmentu Klenov).

Zasady znakowania II:

Nieradioaktywne- np. metody fluorescencyjne- emisja światła o określonej długości fali.

Znaczniki- rodamina, kumaryna, fluoresceina.

Detekcja przy pomocy mikroskopu fluorescencyjnego.

Metody immunochemiczne, cytochemiezne- do sondy włączany jest nukleotyd sprzężony z haptenem (biotyna, digoksygenina, fluoresceina).

Detekcja przy pomocy przeciwciał specyficznych dla danego haptenn Enzymatyczne-do sondy włączany nukleotyd sprzężony z cząsteczką enzymu (np. alkaliczną fosfatazą, peroksydazą). Detekcja oparta na reakcji barwnej katalizowanej przez enzym markerowy. Detekcja na drodze kolorymetrii.

Etapy hybrydyzacji:

•    Frakcjonowanie fragmentów DNA lub RNA w żelu agarozowym (wybrane typu hybrydyzacji nie wymagają tego etapu np. łysinkowa, dot biot, in situ)

•    Denaturacja DNA/RNA. transfer! unieruchomienie na membranie (nitroceluloza, nylon)

•    Hybrydyzacja- inkubacja filtra w roztworze z wcześniej wyznakowaną sondą, w temp ok. 65°C lub 42°C 12-15h

•    Usunięcie z filtra niezwiązanej sondy

•    Wykrywanie hybrydów metodami określonymi przez sposób wyznakowania sondy (np. autoradiografia- znakowanie radioaktywne, barwna reakcja enzymatyczna dla sond nieradioaktywnych).

Typy hybrydyzacji:

Southern:

Sonda i analizowany DNA to cząsteczki odmiennego pochodzenia.

Analizowany DNA po hydrolizie (restiyktazy), frakcjonowany, denaturowany (NaOH), przenoszony na membrany (kopia żelu), ta zanurzana w buforze hybrydyzacyjnym (główny komponent to wyznakowana, jednoniciowa sonda).

Ta, na zasadzie komple men taniości „przyklei się” do fragmentów DNA związanych na membranie wobec których wykazuje homologię (jeśli takich brak to z innymi nie dojdzie do hybrydyzacji sonda-analizowany DNA).

Miejsce identyfikacji sondy umożliwia znacznik z nią związany.

Northern:

Tendencja RNA do tworzenia struktur II i Ill-rzędowych (zaburzają migrację) sprawia, że elektroforeza ptowadzona w warunkach denatunijących (mocznik, formaldehyd, glioksal- powoduą odwracalną modyfikację, znoszą struktury ptzestizenne).

Kolejne etapy jak w Southern.

Aby nie narażać RNA na wysokie temp, dodaje się do roztwoni formamid (pozwala zredukować temp do 42°C (Southern 65°C).

Ostami etap: autoradiografia.

Możliwa ilościowa analiza RNA (np. porównywanie ilości poszczególnych mRNA w komórce w różnych warunkach). Stopień zaczernienia filmu jest miarą ilości tego mRNA w komórkach, z których został izolowany.

Prążki mRNA pochodzące od genów o niskim poziomie ekspresji są mniej intensywne od tych występujących w dużych ilościach (dowód aktywności genów).

Tworzenie cDNA- wykorzystanie zasady hybrydyzacji kwasów nukleinowych (oraz polimeryzacji)