plik

��metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 155 10. SPOS�B UZYSKIWANIA ZGODNORCI PRZEBIEGU PROGRAMU ELUCJI GRADIENTOWEJ W KOLUMNIE Z WYMAGAN� POSTACI� PROGRAMU ORAZ ZAPEWNIENIA ODTWARZALNORCI PARAMETR�W RETENCJI NA DRODZE KOREKTY PROGRAMU ELUCJI Marian Kami�ski, Bogdan Kandybowicz 10.1. WPROWADZENIE W gradientowej aparaturze HPLC z zaworami proporcjonuj�cycmi, przebieg programu elucji na wlocie do kolumny chromatograficznej, cz�sto, z kilku r��nych przyczyn, odbiega od programu oczekiwanego. Rozbie�noS�, mi�dzy zaprogramowanym i zrealizowanym programem elucji, jest spowodowana przede wszystkim mieszaniem cieczy w elementach aparatu oraz op�xnieniem transportowym. W konsekwencji otrzymuje si� nie tylko odchylenia czasu retencji od wartoSci przewidywanych teoretycznie, albo wyznaczonych przez oprogramowanie optyma- lizuj�ce program elucji, ale tak�e, niekorzystn� powtarzalnoS� czasu retencji. Jeszcze wi�kszy problem jest zwi�zany z uzyskiwaniem dobrej odtwarzalnoSci wynik�w rozdzielania z za- stosowaniem r��nych aparat�w i konkretnej metody analitycznej. Oczekuje si�, aby program elucji na wlocie do kolumny chromatograficznej by� zgodny z przebiegiem po��danym. Ten ostatni warunek z regu�y nie jest spe�niony w praktyce, poniewa� aparaty r��nych producent�w charakteryzuj� si� r��nymi wartoSciami obj�toSci mieszania cieczy w przestrzeni mi�dzy wylotem z uk�adu programowania sk�adu cieczy i wlotem do kolumny chromatograficznej. To powoduje, �e ten sam program elucji wprowadzony do sterow- nika programatora eluentu r��nych aparat�w chromatograficznych, prowadzi do otrzymywania na wlocie do kolumny HPLC r��nych funkcji przebiegu programu elucji i r��nych wartoSci czasu retencji tych samych substancji rozdzielanych z zastosowaniem tej samej kolumny. Nasze badania wykaza�y, �e mo�na zastosowa� takie procedury sterowania modu�em wykonawczym systemu programowania sk�adu eluentu (przede wszystkim, zaworami propor- cjonuj�cymi), �e nast�puje eliminacja odchylenia programu elucji otrzymanego na wlocie do kolumny chromatograficznej od ��danej postaci programu. Korekta ta powinna zapewni� nie tylko powtarzalnoS� programu elucji (kt�ra zale�y g��wnie od powtarzalnoSci dzia�ania modu�u programowania sk�adu cieczy), ale tak�e od- twarzalnoS� wynik�w oznacze�. Taki spos�b programowania sk�adu cieczy (wytwarzanie na wlocie do kolumny programu elucji, dok�adnie o ��danej postaci), powinien te� zapewni� efek- tywne stosowanie istniej�cych narz�dzi doboru optymalnego programu elucji oraz mo�liwoS� weryfikacji ich skutecznoSci. 10.2. CZ�R� TEORETYCZNA Przeprowadzono analiz� teoretyczn� kilku wariant�w modelu mieszania cieczy w elemen- tach gradientowego aparatu chromatograficznego, przedstawionego na rys. 1. w formie uog�l- nionej, aktualnej dla gradientowego aparatu chromatograficznego z zaworami proporcjonuj�cy- mi, umieszczonymi po stronie niskiego ciSnienia pompy (tzw. niskociSnieniowy system pro- gramowania sk�adu cieczy). CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 155 metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 156 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... 01 2 3 4 6 5 z A P M Ma Vo z B A+B R Rys. 10.1. Zast�pczy model przyj�ty dla matematycznego opisu zmian sk�adu cieczy w uk�adzie zasi- lania eluentem kolumny chromatograficznej. Oznaczenia: A, B - sk�adniki eluentu, Z - zawory pro- porcjonuj�ce, P - pompa, M - mieszalnik o obj�toSci V, Ma - mieszalnik o obj�toSci Va zast�puj�cy mieszanie cieczy w aparacie poza mieszalnikiem M, Vo -pojemnoS� o t�okowym profilu przep�ywu zast�puj�ca op�xnienie transportowe, R - op�r powoduj�cy podwy�szone ciSnienie pracy pompy, 1-6 - przekroje rozpatrywane w pe�nym opisie modelu. Model na rys. 10.1. mo�e zosta� zastosowany opisu mieszania cieczy w gradientowym aparacie chromatograficznym z zaworami proporcjonuj�cymi, zar�wno, umieszczonymi po stronie wysokiego, jak i niskiego ciSnienia, a tak�e dla aparatu, w kt�rym programowanie sk�adu cieczy odbywa si� na drodze sterowania kilkoma r�wnoczeSnie pracuj�cymi pompami (tzw. wysokociSnieniowy system programowania sk�adu cieczy). Rcis�y opis matematyczny uwzgl�d- niaj�cy wszstkie elementy modelu na rys. 10.1 jest stosunkowo skomplikowany. Do analizy teoretycznej problemu zgodnoSci programu elucji na wlocie do kolumny, z ��dan� funkcj�, zastosowano uproszczony model, kt�ry pozwala �atwo otrzyma� Scis�y opis teo- retyczny. Otrzymane wyniki okaza�y si�, jednoczeSnie, w zadowalaj�cym stopniu przydatne praktycznie. Model ten sk�ada si� z po��czonych wzajemnie szeregowo element�w: Z (pro- gramator programu elucji, generuj�cy w przekroju 1 okreSlon� funkcj� programu elucji), mieszalnik�w M i Ma , kt�re zast�piono jednym mieszalnikiem M o obj�toSci Vz oraz ele- mentu Vo, zast�puj�cego op�xnienie transportowe (kt�re zawsze ma miejsce na drodze: progra- mator programu elucji - kolumna chromatograficzna). Model sk�ada si�, wi�c, tylko z jednego mieszalnika o obj�toSci Vz=V+Va, zast�puj�cego mieszanie cieczy w przestrzeni mi�dzy elemen- tami wykonawczymi programatora sk�adu eluentu oraz z elementu (Vo), zast�puj�cego op�xnie- nie transportowe mi�dzy wylotem z programatora sk�adu eluentu i wlotem do kolumny chro- matograficznej. Analiza teoretyczna takiego modelu, w przypadku liniowego programu elucji, ��danego na wlocie do kolumny chromatograficznej (w przekroju 5 ), prowadzi do nast�puj�cych wniosk�w: - Gdy programator sk�adu eluentu realizuje w przekroju 1 liniow� funkcj� programu elucji (1) w postaci: X = at + b (1) - to w stanie ustalonym (t >> TA = Vz/w), otrzymamy na wylocie z mieszalnika Vz (w przekroju 4 ) nast�puj�cy przebieg (2) funkcji programu elucji : X1(t) = at + b - a TA (2) Czytelnik mo�e samodzielnie wyprowadzi� odpowiednie zale�noSci, je�eli ma ch�� po�wiczy� uk�adanie i rozwi�zywanie prostych r�wna� r��niczkowych, maj�cych praktyczne zastosowanie. W warunkach stanu niestabilnego zale�noSc (2) jest bardziej z�o�ona. 156 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 157 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... Analiza r�wna�, prowadz�cych do otrzymania zale�noSci (2) w okresie, zar�wno stanu ustalonego, jak i w stanie nieustalonym, sugeruje mo�liwoS� takiego przekszta�cenia programu sterowania elementami wykonawczymi urz�dzenia gradientowego (zaworami proporcjonuj�cy- mi, lub r�wnolegle pracuj�cymi pompami), aby na wlocie do kolumny otrzymywa� po��dany program elucji, zgodny z r�wnaniem (1). W przypadku liniowego programu elucji, przebieg skorygowany programu przedstawia si� nast�puj�co: X ()= (at + b) + TA�"a + � (t)�"TA�"[b - X1(0)] (3) t k gdzie: w - obj�toSciowe nat��enie przep�ywu eluentu w kolumnie; �(t) - delta Diraca; X1(0) - pocz�tkowa zawartoS� sk�adnika B w mieszalniku Vz w czasie t = 0 (w praktyce wartoS� b), a wi�c ostatni sk�adnik zale�noSci (3) wynosi zero; W konsekwencji, w przypadku ��dania otrzymywania liniowego programu elucji w kolumnie, gdy do programatora sk�adu eluentu zostanie wprowadzona skorygowana funkcja pro- gramu o postaci zale�noSci (3) oraz, zostanie skorygowany moment wprowadzenia pr�bki do kolumny o wartoS� op�xnienia transportowego (t0 = Vo/w) - to na wlocie do kolumny chro- Rys. 10.2. Schematyczne wykresy, zwi�zane ze zniekszta�ceniem i korekt� liniowego programu elucji, gdy aparat chromatograficzny mo�na modelowa� obiektem inercyjnym I rz�du (idealnym mieszal- nikiem) o obj�toSci Vz = V+Va. Program po��dany: X = at+b; Program skorygowany: X = at+b+(aTA). a - po��dany przebieg programu elucji na wlocie do kolumny chromatograficznej, a' - rzeczywisty przebieg programu elucji (linia ci�g�a), otrzymany na wlocie do kolumny chro- matograficznej, gdy programator wykonuje program naszkicowany lini� kreskow�; b - programator wykonuje program skorygowany, zgodny z lini� ci�g��; b' - przebieg programu elucji, zrealizowany na wlocie do kolumny w wyniku wprowadzenia do pro- gramatora programu skorygowanego "b". CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 157 metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 158 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... matograficznej (w przekroju 5 ), powinna zosta� otrzymana dok�adnie funkcja programu elucji w postaci r�wnania (1). Schematy przedstawione na rys. 10.2. stanowi� graficzn� ilustracj� wyniki studi�w teore- tycznych, dla oczekiwania liniowego przebiegu funkcji programu elucji w kolumnie (przy czym, wartoS� Xp na rys. 2 jest to�sama z a�"TA w r�wnaniach (1) do (3)). Podobne wnioski otrzymano tak�e dla wybranych, nieliniowych postaci programu elucji. W konsekwencji, w mySl streszc- zonych tu wynik�w rozwa�a� teoretycznych, program elucji, otrzymywany na wlocie do kolum- ny chromatograficznej, mo�e by� dok�adnym odwzorowaniem postaci funkcji, kt�ra jest oczeki- wana. 10.3. CZ�R� DORWIADCZALNA Zastosowano dwa r��ne komercyjne analityczne gradientowe chromatografy cieczowe z zaworami proporcjonuj�cymi po stronie ss�cej pompy, charakteryzuj�ce ci� zr��nicowanymi wartoSciami parametr�w dynamiki mieszania cieczy w przestrzeni przed wlotem do kolumny chromatograficznej. W tabeli 10.1 podano dla obu aparat�w wartoSci parametr�w dynamiki mieszania cieczy oraz przebiegi funkcji programu elucji, wprowadzone do programatora. Zast�pcz� obj�toS� mieszania Vz w elementach aparatu na drodze od zawor�w proporcjonuj�- cych do wlotu do kolumny chromatograficznej oraz wynikaj�c� z niej zast�pcz� sta�� czasow� TA (TA= Vz/w) wyznaczono stosuj�c stosuj�c metod� 0.632 . Wp�yw korekty programu elucji na wartoS� parametr�w retencji substancji rozdzielanych w warunkach elucji gradientowej badano dla wartoSci nat��enia przep�ywu w=1,5 cm3/min., z zastosowaniem typowej kolumny Lichrospher Rp18 5 �m o wymiarach 125x4 mm i 250 x4 mm, rozdzielaj�c acetanilid i w�glowodory aromatyczne. Zastosowano, cz�sto wykorzystywan� w praktyce, wartoS� gradientu st��enia ok. 4,5 %/min. w zakresie od 4% do 90% metanolu w wodzie. Analizowano te� wp�yw op�xnienia transportowego. Dzi�ki obecnoSci acetonu w cieczy A (0,025% v/v) i cieczy B (0,1% v/v) i zastosowaniu detektora UV dla d�ugoSci fali 265 nm otrzymywano jednoczeSnie chromatogramy oraz orienta- cyjne przebiegi zmian udzia�u sk�adnika B w eluencie na wylocie z kolumny (zniekszta�cone z powodu sorpcji acotonu na powierzchni sorbentu Rp18). 10.4. WYNIKI I WNIOSKI W badaniach zastosowane dwa r��ne gradientowe aparaty chromatograficzne, scharak- teryzowane w tab. 1 pod wzgl�dem wartoSci parametr�w dynamiki mieszania cieczy i odpowied- nich skorygowanych postaci programu elucji. Tabela 10.1 Parametry dynamiki mieszania cieczy w aparatach wykorzystanych w doSwiadczeniach, kt�rych wyniki przedstawiono na rysunku 5 i w tabeli 2 oraz 3. Op�xnienie Zast�pcza obj�toS� Posta� skorygowanego Lp. Nazwa aparatu transportowe mieszania cieczy programu elucji y=a t �" [cm3] / [min] [cm3] / [min] (y=a t + b�"TA) 1 LaChrom (Ap.1) 0.6 / 0.4 0.35 / 0.23 4.3 %/min �" t + 1% 2 Lichrograph (Ap.2) 2.4 / 1.6 1.05 / 0.7 4.3 %/min �" t + 3% 158 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 159 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... Rozpatrywano trzy warianty korekty programu elucji i momentu wprowadzenia pr�bki do kolumny, zilustrowane na rysunku 10.4: a) Pr�bk� dozowano ignoruj�c istnienie zar�wno op�xnienia transportowego, jak i mieszania cieczy przed wlotem do dozownika (tak jak, ma to miejsce dotychczas, bez korekty - rysunek 10.4a), b) Pr�bk� dozowano z op�xnieniem w stosunku momentu uruchomienia programatora gradientu elucji; wielkoS� op�xnienia, tak dobrana, by pr�bka trafi�a w kolumnie na pocz�tek realizacji programu elucji, jednak nie korygowano programu elucji ze wzgl�- du na mieszanie cieczy przed wlotem do kolumny (rysunek 10.4b), c) Uwzgl�dniono obydwa efekty powoduj�ce odchylenie programu elucji od ��danego przebiegu, tj. dozowano z uwzgl�dnieniem op�xnienia transportowego oraz skorygowano program elucji (rysunek 10.4c). Rys. 10.3. Schematyczne przedstawienie przebieg�w programu elucji (X2) na wlocie do kolumny chro- matograficznej w relacji do momentu dozowania pr�bki: a) przy braku korekty programu elucji i nie uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego b) po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego ale bez korekty programu elucji, c) po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji. Linia kreskowa - po��dany przebieg programu elucji, linia ci�g�a - zrealizowany przebieg programu elucji, strza�k� zaznaczono moment dozowania pr�bki. t0 op�xnienie transportowe. Na rysunku 10.3 lini� kreskow� zaznaczono po��dany przebieg programu elucji, lini� ci�g�� zrealizowany przebieg programu elucji, zaS strza�k� moment dozowania pr�bki. Jak wida�, przy uwzgl�dnieniu tylko korekty op�xnienia transportowego (rysunek 10.3b), nast�puje przesuni�cie programu elucji w kolumnie wzd�u� osi czasu wzgl�dem momentu dozowania pr�b- ki. W przypadku ca�kowitej korekty (rysunek 10.3.c) nast�puje tak�e zmiana charakteru funkcji CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 159 metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 160 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... opisuj�cej przebieg funkcji programu elucji zrealizowany na wlocie do kolumny i dostosowanie jej do po��danego (w tym przypadku - liniowego) przebiegu. Ma miejsce usuni�cie pocz�tkowego zagi�cia krzywej programu elucji oraz eliminacja dodatkowego przesuni�- cia tej linii spowodowanego mieszaniem cieczy przed wlotem do kolumny. R��nice przebiegu programu elucji w kolumnie przek�adaj� si� na r��nice czasu i obj�toS- ci retencji rozdzielanych substancji. R��nice obj�toSci retencji s� wzgl�dnie tym wi�ksze im wi�ksze jest op�xnienie transportowe, im wi�ksza jest wartoS� zast�pczej sta�ej czasowej TA oraz im mniejsza jest obj�toS� wype�nienia kolumny. Dodatkowo, przesuni�cie czasu retencji jest tym wi�ksze, im mniejsze jest nat��enie przep�ywu eluentu (w). Rys. 10.4. Zestawienie trzech do szeSciu na�o�onych chromatogram�w otrzymanych w warunkach elucji gradientowej z zastosowaniem dw�ch typ�w aparat�w chromatograficznych (Ap.1 i Ap.2) : A. przy braku korekty programu elucji i nieuwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego, B. po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego, ale bez korekty programu elucji, C. po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji. Po��dany program elucji X = 4,3[%/min.] * t + 4% do 90%, ciecz A - woda + 0,025% acetonu, ciecz B - metanol + 0,1% acetonu, w=1,5 cm3/min., kolumna - Lichrospher RP 18 5�m, 125x4 mm, t=30�C. Ap. 1 - LaChrom (Merck-Hitachi), Ap. 2 - Lichrograph (Merck-Hitachi). Rozdzielane substancje: 1 acetanilid, 2 - benzen, 3 - toluen, 4 - o-ksylen, 5 - n-butylobenzen. 160 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 161 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... Tabela 10.2. Zestawienie Srednich wartoSci czasu retencji bez i po zastosowaniu korekty programu elucji A. przy braku korekty programu elucji i nie uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego, B. po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego, ale bez korekty programu elucji, C. po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji. A B C Aparat: Ap. 1 Ap.2 Ap. 1 Ap.2 Ap. 1 Ap.2 Substancja: [min.] [min.] [min.] [min.] [min.] [min.] Acetanilid 6,82 8,21 6,88 6,85 6,09 6,08 Benzen 12,5 14,06 12,46 12,38 11,65 11,66 Toluen 16,62 16,81 15,20 15,11 14,64 14,65 o-ksylen 16,91 18,47 16,90 16,84 16,34 16,35 n-butylo-benzen 19,51 21,37 19,45 19,41 18,99 19,01 Potwierdzaj� to, przedstawione na rysunku 10.4 i 10.5, przyk�ady chromatogram�w uzyskanych dla dw�ch aparat�w w warunkach elucji gradientowej oraz zawarte w tabeli 1 wartoSci czasu retencji i zawarte w tabeli 10.3 wartoSci powierzchni pik�w, otrzymane: A. przy braku korekty programu elucji i nie uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego, rysunek 10.4a, Tabele 10.2 i 10.3 kolumna A ; B. po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego, ale bez korekty programu elucji, rysunek 10.4b, Tabele 10.2 i 10.3 kolumna B ; C. po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji, rysunek 10.4c, Tabele 10.2 i 10.3 kolumna C. Na podstawie chromatogram�w na rys 10.4 i 10.5 oraz wartoSci czasu retencji, zamieszc- zonych w Tabeli 10.2, wida�, �e czas retencji substancji rozdzielanych w warunkach elucji gra- dientowej r��ni si� znacznie bez i z zastosowaniem korekty programu elucji. Wida� te�, �e najwi�ksze znaczenie przy przenoszeniu parametr�w retencji mi�dzy aparatami o r��nych wartoSciach dynamiki mieszania, ma uwzgl�dnienie op�xnienia transportowego, a dopiero w nast�pnej kolejnoSci korekta programu elucji uwzgl�dniaj�ca mieszanie cieczy. Jednak, w przy- padku chromatografii cieczowej z tzw. kolumnami mikropakowanymi znaczenie obu rodzaj�w korekty b�dzie podobne. Powy�sze wyniki dobitnie te� dokumentuj�, �e bez zastosowania odpowiedniej korekty programu elucji nie mo�na oczekiwa� zadowalaj�cej odtwarzalnoSci parametr�w retencji mi�dzy aparatami o r��nych wartoSciach parametr�w dynamiki mieszania cieczy przed wlotem do kolumny chromatograficznej, szczeg�lnie, gdy znaczne s� r��nice op�xnienia transportowego. Wida� te�, �e stosowanie w praktyce narz�dzi programowych przewiduj�cych parametry retencji na podstawie przebiegu funkcji programu elucji, wymiar�w kolumny i nat��enia przep�ywu eluentu, musi by� obarczone okreSlonym b��dem, gdy nie uwzgl�dnia si� wp�ywu mieszania cieczy w przestrzeni przed wlotem do kolumny chromatograficznej, a zw�aszcza wp�y- wu op�xnienia transportowego. Mo�na doda�, �e wtedy, gdy eluent A (tzn. eluent, od kt�rego rozpoczyna si� program elucji) posiada znikom� si�� elucyjn�, w�wczas korygowanie momentu dozowania pr�bki o wartoS� op�xnienia transportowego nie jest konieczne. Dop�ki eluent ma zerow� si�� elucyjn�, to znaczy do czasu, gdy nie zacznie wp�ywa� do kolumny sk�adnik B eluentu, substancje CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 161 metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 162 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... Rys. 10.5. Ilustracja wp�ywu rodzaju korekty programu elucji na czas retencji dla aparatu Lichrograph. Symbolem "I" oznaczono chromatogramy otrzymane przy braku korekty programu elucji, a symbol- em "II", odpowiednio, chromatogramy: a) gdy skorygowano tylko wp�yw mieszania cieczy przed wlotem do kolumny, b) gdy skorygowano tylko wp�yw op�xnienia transportowego, c) gdy skorygowano oba efekty jednoczeSnie. Po��dany program elucji X = 5[%/min.] * t, ciecz A - woda, ciecz B - metanol + 0,1% acetonu, w=1,5 cm3/min., kolumna - Lichrospher RP 18 5 m, 125x4 mm, t=30�C. Substancje: 1 - acetanilid, 2 - benzen, 3 - toluen, 4 - o-ksylen, 5 - n butylobenzen. rozdzielane nie podlegaj� elucji. Wtedy wystarczy zastosowa� tylko korekt� uwzgl�dniaj�c� mieszanie cieczy. Na podstawie danych w tabeli 10.3 wida�, natomiast, �e stosowanie korekty programu elucji ma przede wszystkim znaczenie dla otrzymywania oczekiwanych wartoSci czasu (obj�toS- ci) retencji i nie ma du�ego wp�ywu na odtwarzalnoS� oraz powtarzalnoS� powierzchni pik�w, w konsekwencji, na mo�liwoS� przenoszenia parametr�w kalibracyjnych mi�dzy r��nymi aparata- mi, gdy czu�oSci detektora i warunki dozowania i chromatografowania s� takie same. Jedynie, gdy zastosowanie korekty programu elucji znacznie zmieni czas retencji, to mo�na spodziewa� si� r��nic wartoSci powierzchni pik�w i w konsekwencji, r��nic wartoSci wsp��czynnik�w kali- bracyjnych, szczeg�lnie dla substancji o niskich i wysokich wartoSciach czasu retencji. 162 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 163 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... Tabela 10.3. Zestawienie Srednich wartoSci powierzchni pik�w bez i po zastosowaniu korekty progra- mu elucji uwzgl�dniaj�cej wp�yw zast�pczej obj�toSci mieszania cieczy przed wlotem do kolumny oraz bez i po uwzgl�dnieniu wp�ywu op�xnienia transportowego na przebieg programu elucji (prowadz�cych do otrzymywania odpowiednich chromatogram�w przedstawionych na rysunku 4) A) brak korekty programu elucji i nie uwzgl�dnienie op�xnienia transportowego; B) po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego ale bez korekty programu elucji ze wzgl�du na dynamik� mieszania cieczy przed wlotem do kolumny; C) po uwzgl�dnieniu op�xnienia transportowego oraz zastosowaniu korekty programu elucji eliminuj�cej mieszanie cieczy. *) - w nawiasach podano r��nice wartoSci Srednich powierzchni pik�w. A B C Aparat: Ap. 1 Ap.2 Ap. 1 Ap.2 Ap. 1 Ap.2 Substancja: [mVs] [mVs] [mVs] [mVs] [mVs] [mVs] 10836 10710 10700 Acetanilid 10679 10640 (157) *) 10634 (76) (60) 271 267 265 Benzen 266 264 263 (5) (3) (2) 639 658 668 Toluen 631 651 662 (8) (7) (6) 924 925 926 o-ksylen 911 916 922 (13) (9) (4) 796 791 788 n-butylobenzen 776 779 783 (20) (12) (5) Tabela 10.4. Zestawienie wartoSci czasu retencji, zast�pczych obj�toSci mieszania, sta�ych czasowych oraz odpowiadaj�ce im r�wnania skorygowanego programu elucji, wykorzystane do otrzymania chro- matogram�w na rysunku 10.6. Chromatogram na A B C rysunku 5 V0 [cm3] / t0 [min] 3,0 / 2,0 3,0 / 2,0 3,0 / 2,0 Vz [cm3] / TA [min.] 1,05 / 0,7 1,40 / 0,93 1,74 / 1,16 R�wnanie skorygowanej 4,3[%/min.]�"t+7[%] 4,3[%/min.]�"t+8[%] 4,3[%/min.]�"t+9[%] funkcji programu elucji Substancja Czas retencji [min] 1. Acetanilid 6,14 5,99 5,81 2. Benzen 11,71 11,56 11,33 3. Toluen 14,6 14,4 14,2 4. o-ksylen 16,3 16,1 15,8 5. n-butylobenzen 18,9 18,7 18,4 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 163 metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 164 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... Rys. 10.6. Ilustracja wartoSci wp�ywu zast�pczej obj�toSci mieszania przyj�tej do obliczenia korekty programu elucji na czas retencji dla aparatu Lichrograph. Po��dany program elucji X = 4,3[%/min.] *t, + 4% do 90%, op�xnienie transportowe �0=3 cm3, t0 = 2 min., ciecz A - woda, ciecz B - metanol + 0,1% acetonu, w=1,5 cm3/min., kolumna - Lichrospher RP 18 5 m, 125x4 mm, t=30�C. Przyj�te wartoSci zast�pczych obj�toSci mieszania, sta�ych czasowych oraz odpowiadaj�ce im r�wna- nia skorygowanego programu elucji : a - Vz=1,05 cm3, TAz = 0,7 min., X = 4,3[%/min.]*t+7[%], b - Vz=1,40 cm3, TAz = 0,93 min., X = 4,3[%/min.]*t+8[%], c - Vz=1,74 cm3, TAz = 1,16 min., X = 4,3[%/min.]*t+9[%], Rozdzielane substancje: 1 - acetanilid, 2 - benzen, 3 - toluen, 4 - o-ksylen, 5 - n butylobenzen. Zbadano te� wp�yw niedok�adnego wyznaczenia zast�pczej obj�toSci mieszania Vz zas- tosowanej do okreSlenia skorygowanego programu elucji na uzyskiwane wartoSci czasu retencji. Na rysunku 6 przedstawiono chromatogramy otrzymane dla trzech program�w elucji, r��ni�cych si� wartoSci� zast�pczej obj�toSci mieszania przyj�t� do obliczenia korekty programu elucji, a co za tym idzie, r��ni�cych si� parametrem b w r�wnaniu prostej, opisuj�cej skorygowany pro- gram elucji wprowadzany do programatora. W tabeli 10.4 zestawiono wartoSci zast�pczej obj�toSci mieszania przyj�te do korekty, odpowiadaj�ce im wartoSci zast�pczej sta�ej czasowej, postaci skorygowanych r�wna� progra- mu elucji dla odpowiednich chromatogram�w oznaczonych na rysunku 10.6 jako a, b, c oraz podano uzyskane czasy retencji poszczeg�lnych rozdzielanych substancji. Wida�, �e przy doS� du�ej zmianie zast�pczej obj�toSci mieszania, o 0,4 cm3, wykorzysty- wanej dla korygowania programu elucji, zmiany uzyskiwanych wartoSci czasu retencji s� wzgl�dnie niedu�e (na poziomie ok. 0,2 min). Oznacza to, �e niewielkie b��dy w wyznaczaniu zast�pczej obj�toSci mieszania nie powinny powa�nie pogorszy� odtwarzalnoSci czasu retencji. Wszystkie wykonane badania wykaza�y niewielki, praktycznie pomijalny, wp�yw sposobu i stopnia korekty programu elucji na powtarzalnoS�: czasu retencji oraz powierzchni pik�w - dla 164 CHROMATOGRAFIA CIECZOWA metoda uzyskiwania zgodnosci przebiegu.qxp 2004-06-16 23:58 Page 165 Spos�b uzyskiwania zgodnoSci przebiegu programu elucji gradientowej w kolumnie z wymagan� postaci� ... tego samego aparatu, kolumny i tych samych warunk�w rozdzielania. Wydaje si� to oczywiste, tak�e intuicyjnie, poniewa� charakter funkcji programu elucji powinien mie� drugorz�dny wp�yw na powtarzalnoS� otrzymywanych wartoSci czasu retencji oraz powierzchni pik�w chro- matograficznych. O powtarzalnoSci uzyskiwania w/w parametr�w w warunkach kolumnowej chromatografii cieczowej z wykorzystaniem programowania sk�adu cieczy decyduje przede wszystkim powtarzalnoS� wytwarzania przez aparat okreSlonej wartoSci sk�adu eluentu, czy powtarzalnoS� wytwarzania okreSlonej (niekoniecznie ��danej) postaci programu elucji, w tym dok�adnoS� i stabilnoS� pracy pompy. Zupe�nie inaczej ma si� sprawa z odtwarzalnoSci� czasu retencji z zastosowaniem r��nych aparat�w HPLC. Wykazano, �e z wykorzystaniem tej samej kolumny i programu elucji, czas i obj�toS� retencji mog� znacznie r��ni� si� co do wartoSci tego samego, gdy nie zostanie zas- tosowana korekta programu elucji, a wartoSci op�xnienia transportowego i zast�pcze obj�toSci mieszania dw�ch aparat�w s� r��ne. Znaczenie symboli a, b - wsp��czynniki w liniowym programie elucji gradientowej (X = at+b), t - czas, wyra�ony w [s] albo [min.], t0 , T0 - op�xnienie transportowe, wyra�one w [s], albo [min.], TA - zast�pcza sta�a czasowa mieszalnika i aparatu, modelowana pojedynczym elementem inercyjnym I rz�du, [s] albo [min.], Vo, �0 - op�xnienie transportowe wyra�one w [cm3], Vz - zast�pcza obj�toS� mieszania w mieszalniku i aparacie chromatograficznym modelowanym elementem inercyjnym I rz�du, wyra�ona w [cm3], w - obj�toSciowe nat��enie przep�ywu fazy ruchomej przez kolumn� chromatograficzn�, wyra�one w [cm3 /min.], X, X2 - st��enie obj�toSciowe sk�adnia B, C, & w eluencie, wyra�one jako udzia� obj�toSciowy [v/v] (u�amek obj�toSciowy), albo [% v/v] (procent obj�toS- ciowy). CHROMATOGRAFIA CIECZOWA 165

Wyszukiwarka

Podobne podstrony:
Dieta na masę do 72kg
program egzaminów na uprawnienia budowlane styczeń 2010
Blues na wpół do piątej rano Universe
CO ROZPOZNAJE UKŁAD IMMUNOLOGICZNY NA DRODZE DO NOWEGO PARADYGMATU
Program diety na dni Elavia
zapotrzebowanie na ciepło do wentylacji
,,Polityka Oświatowa Samorządu Terytorialnego koncepcja programu ,, opracowanie na zaliczenie POL
finanse na ubezpieczenia do wysłania [tryb zgodności]
7 2008 Na lekcje do muzeum
11 lab Remonty i naprawy obr mat na wejść i do sprawid461

więcej podobnych podstron