83336

Z krzywej kalibracyjnej odczytać stężenie (yig/inl) monosacharydów uwolnionych podczas enzymatycznej hydrolizy sacharozy, a następnie obliczyć ilość powstałych produktów uwzględniając rozcieńczenie mieszaniny inkubacyjnej (30x):

Ilość produktu (pg) = A_5M ^x f (pg/ml) ^x 1 ml * 30

Dla każdego stężenia enzymu (rozcieńczeń: „1/8”. „1/4”, 1/2”, „1”) sporządzić krzywą progresji - wykres zależności ilości produktu (mg) od czasu reakcji (min.) i wyznaczyć szybkość początkową reakcji (w mg glukozy-fnrktozy uwolnionych na minutę).

Sporządzić wykres przedstawiający zależność szybkości początkowej v₀ (mg/min) od stężenia enzymu.

pH środowiska (Ćwicz. 5)

Większość enzymów wykazuje maksymalną aktywność w środowisku o określonym stężeniu jonów wodorowych. W miar ę oddalatria się od optimum pH aktywność enzymów spada, ponieważ jony wodorowe i wodorotlenowe w większym stężeniu powodują inaktywację poprzez rozrywanie wiązań jonowych i wodorowych pomiędzy grupami funkcyjnymi łańcuchów bocznych, stabilizujących strukturę przestrzenną enzymu.

Zależność aktywności enzymów od pH jest spowodowana stopniem zjonizowania enzymu, substratu i kompleksu enzym-substrat. Grupy czynne centrum aktywnego enzymu wykazują właściwości katalityczne tylko w jednej z jonowych form, podobnie w przypadku substratu tylko jedna z możliwych form jonizujących jest rzeczywiście aktywna w reakcji enzymatycznej. Ładunek substratu i enzymu ma znaczenie przy tworzeniu kompleksu enzym-substrat, ponieważ siły wiążące mogą mieć char akter elektrostatyczny. Optimum pH i kształt krzywych zależności aktywności od pH mogą się dla danego enzymu różnić w zależności od reagującego substr atu.

Optymalne dla danego enzymu pH utrzymuje się podczas oznaczania aktywności za pomocą odpowiednio dobranego bitfom. Istotne znaczenie mają: rodzaj, ilość użytego bufom, jego siła jonowa i pojemność buforowa. Rozpuszczalność białek enzymatycznych, ich konformacja zależą od siły jonowej roztworu, a więc od stężenia i wartościowości występujących w nim jonów. Pojemność buforowa wzrasta wraz ze stężeniem roztworu, a maleje z rozcieńczeniem. Dlatego rozcieńczanie buforu, choć nie zmienia pH, to jednak ujemnie wpływa na pojemność buforową, ma to szczególne znaczenie przy reakcjach enzymatycznych, w których powstają produkty kwasowe.

Wybór odpowiedniego bufom jest bardzo ważny, ponieważ niektóre jego składniki np. fosforany, estry fosforanowe, kwasy karboksylowe - będące naturalnymi metabolitami -mogą wiązać się z enzymem i zmieniać jego aktywność. Bufory boranowe często są nieodpowiednie ze względu na kompleksowanie różnych alkoholi wielowodorotlenowych, rybonukleotydów i węglowodanów.

2