8

Enzymy 127

2. Z krzywej kalibracyjnej odczytać ilość enzymu w próbie.

Podać stężenie trypsyny w próbie indywidualnej (jag enzymu/ ml roztworu).

Materiały i odczynniki

roztwór enzymu: około 2 mg trypsyny rozpuścić w 5 ml 1 mM HC1 z 80 raM CaCl₂; zmierzyć absorbancję roztworu przy 280 nm i uzyskaną wartość pomnożyć przez 0,67 - wagowy współczynnik absorpcji dla trypsyny (odwrotność właściwego współczynnika absorpcji), uzyskując ilość mg trypsyny w 1 ml; roztwór enzymu rozcieńczyć 1 mM HC1 z 80 mM CaCl₂ tak, aby zawierał 40 pg/ml 1% roztwór substratu: 1 g kazeiny zawiesić w 100 ml 0,2 M buforu Tris-HCl o pH 8,0 i gotować na wrzącej łaźni przez 15 minut; po ostygnięciu uzupełnić wodą do 100 ml roztwór kwasu trichlorooctowego (TCA); 18 g TCA, 18 g bezwodnego octanu sodu i 20 ml lodowatego kwasu octowego uzupełnić wodą do 1 000 ml 0,2 M bufor Tris/HCl o pH 8,0 1 mM HC1 zawierający 80 mM CaCl₂

4.5.2. Wykazywanie aktywności trypsyny wobec kazeiny i wpływ inhibitora na jej -ktywność

KAkade M.L., Swcnson D.H., Liener I.E. (1970) Anal. Biochem. 33, 255-258.

Z- adę metody opisano szczegółowo w rozdziale 4.5.1.

- stępowanie

Do 5 probówek odpipetować następujące objętości roztworu enzymu, 0,2 M buforu Tris/HCl o pH 8,0 i inhibitora:

nr próby	enzym [ml]	bufor [ml]	inhibitor [ml]
1	0,50	0,50	-
2	0,25	0,75	-
3	0,10	0,90	-
4 (kontrola)	-	1,00	-
5	0,50	0,40	0,10

I Wstawić probówki do łaźni wodnej o temp. 37°C i po 5-10 minutach preinkubacji dodać w odstępach 30 sekundowych do każdej probówki po 1 ml 1% kazeiny (substrat), ogrzanej do temp. 37°C.

Dokładnie po 10 minutach reakcję przerwać przez dodanie do każdej próby 3 ml roztworu kwasu trichlorooctowego (również w odstępach 30 sekund, zachowując tę samą kolejność pipetowania); próby należy dokładnie wymieszać.

Wyjąć probówki z łaźni i po 15 minutach odwirować osad niestrawionej kazeiny. Odczytać A₂₈₀ w supernatantach wobec wody w kolejności od próby 5 do 1.

IC:eriaty i odczynniki

roztwór inhibitora trypsyny (z nasion soi) o stężeniu 1 mg/ml pozostałe odczynniki jak w ćw. 4.5.1