84757

denaturacji dsDNA, jedna nic (raebiotynylowana)jest odrywana i otrzymujemy pojednynczą nić DNA związaną ze stałym nośnikiem (biotynyiowaną). która służy za matrycę do sekwencj onowania.

Tu dla pizypomnienia schemat syntezy DNA.

(DNA)_n+dNTP—>polimeraza—>(DNA)_n+i+PPi

I tu tkn i klucz do pirosekwencjonowania, ponieważ podczas wbudowywania nukleotydu uwalnia się PPi ipirofosforaw. Nazara pirosekwencjonowanie nawiązuje do pirofo sforami wiośnie.

Oprócz polimerazy w mieszaninie rekacyjnej są jeszcze inne enzymy. Pierwszym z nich jest sulfurylaza.

SULFURYLAZA (ang. sulfuiylase)

- katalizuje reakcję APS z PPi. powstaje ATP

LUCYFF.RAZA (ang. luciferase)

Lucyferaza+ATP -> oksylucyferyna + światło

Każde przekształcenie lucyferyny w oksylucyferynę powoduje emisję światła. Tą droga każde wbudowanie nukleotydu skutkuje emisją światła.

Skąd wiadomo jaki nukleołyd został wbudowany?

Najpieiw dodajemy ATP. Jeśli jest komplementarne - mamy sygnał światła. Jeśli nie -sygnału brak. Wtedy usuwany nadmiar ATP i dodajemy następny. Zęby mieć pewność, że substratu nie ma w układzie jest jeszcze jeden enzym.

APYRAZA (ang. apyrase) rozkłada dNTP

dNTP- dNDP + dNMP + fosforan np. ATP—AD P+AMP+fosforan skutkuje brakiem substratu w układzie.

dNTP w nadmiarze —* wbudowanie pizez polimerazę (jeśli jest w matrycy) —* sygnał świetlny —‘działanie apyrazy (usuniecie nadmiaru substratu) -♦wymywanie pozostałości. Uwaga: te świecące też są wymywane!

Jeśli sygnał jest wysoki to znaczy, że reszty takie same następują po sobie w sekwencji (przedstawione na sdiemacie).

SYGNAŁ JEST PROPORCJONALNY DO ILOŚCI RESZT.