84760

Teraz chciałem pokazać państwu jak używa się genu reporterowego. Jeden z wielu przykładów to test CAT assay, często używany w biologii molekularnej do badania aktywności komórkowej. Test, w którym wykorzystuje się acetylotransferazę chloramfenikolu.

Tu się przygotować na masło maślane!

Na początku jest plazmid, w którym mamy gen x - gen, którego promotor chcemy zbadać. W tych wszystkich testach analizujemy funkcję promotora. I aby układ dostosować do układu testu z genem reporterowym, X jest usuwany, np. przez trawienie enzymem restrykcyjnym. Na jego miejsce wstawiany jest gen cat. Promotor zostaje. Ten układ jest trochę wydumany, dlatego że zwykle to akurat na odwrót się robi. Tzn. dysponujemy wektorem, w którym jest promotor podstawowy, pod którego kontrolą jest gen cat. I tu byłby cat i jakiś promotor podstawowy. Do tego dokładamy region promotora, który chcemy badać. Można też oczywiście usunąć ten podstawowy promotor i cały promotor umieścić przed genem cat, tak że dostaniemy taki rekombinowany konstrukt - promotor, a pod jego kontrolą gen cat. Teraz ten konstrukt transformuje komórki eukariotyczne. Cat bowiem jest bakteryjny, nie ma jego odpowiednika w komórkach eukariotycznych. Następnie komórki są jakiś czas utrzymywane w warunkach hodowli, po to żeby w komórkach nagromadził się produkt ekspresji cat, czyli acetyłotransferaza chloramfenikolu. Trwa to kilkanaście godzin, żeby enzym pojawił się w komórce.

Musimy w dalszej części eksperymentu sprawdzać czy faktycznie aktywność cat jest obecna w komórkach Przygotowuje się zatem ekstrakt komórkowy, który jest inkubowanyz substratami. Substratem jest chloramfenikol, antybiotyk, naturalny substrat acetylotransferazy chloramfenikolu, oraz acetyloCoA.Te 2 związki dodawane są do ekstraktu. Chloramfenikol jest znakowany radioaktywnie ^UC. Całość inkubowana. Analizujemy skutek reakcji, czyli czy chloramfenikolu uległ acetylacji (przez cat). Najprostszy sposób analizy to chromatografia cienkowarstwowa. Na rys. widać, że naniesiono na płytkę 3 próbki. Ponieważ substrat jest radioaktywny, to po rozwinięciu