98105

towarzyszących. Temperaturę ogrzewania można podwyższyć nie powodując inaktywacji enzymu, gdy do roztworu zostanie dodany związek swoiście się z tym enzymem łączący.

Zmiana pH roztworu lub też obniżenie jego siły jonowej do bardzo niskich wartości może również doprowadzić do usunięcia wielu białek towarzyszących.

Bardzo szeroko stosowanymi metodami rozdziału białek są metody chromatograficzne. Obejmują one następujące sposoby frakcjonowania:

•    sączenie molekularne - technika wykorzystująca różnice w wielkości rozdzielanych cząstek; mieszanina substancji o różnej masie cząsteczkowej przepływa przez kolumnę wypełnioną porowatym hydrofilnym żelem o określonej wielkości porów, zrównoważonym odpowiednim buforem; cząsteczki zbyt duże, aby wniknąć do ziaren żelu, przepływają między nimi i pojawiają się w eluacie lako pierwsze, substancje o niższej masie cząsteczkowej wnikają do ziaren żelu. są więc opóźniane na kolumnie; pojawiają się w cluację w porządku od najmniejszych do największych

•    chromatografia jonowymienna - kolumna chromatograficzna wypełniona jest celulozowym wypełniaczem jonowym, do którego wiążą się białka obdarzone przeciwnym niż wymieniacz ładunkiem, białka obdarzone tym samym ładunkiem przepływają swobodnie przez kolumnę. Białka połączone z wypełniaczem uwalnia się poprzez wprowadzenie do układu czynników konkurujących z białkami o miejsce na wypełniaczu

•    chromatografia adsorpcyjna - kolumna wypełniona jest nieorganicznym materiałem (np. hydroksyapatyt), który adsorbuje białko na zasadzie oddziaływań Van der Waals’a

•    chromatografia powinowactwa - rzadko stosowana na większą skalę ze wzgl. na wysokie koszty i niestabilność wypełniacza kolumny, który powinien być specyficzny dla danego enzymu, gdyż ligandem, do którego wiąże się pozyskiwany enzym jest w tym przypadku substrat danego enzymu, jego analog bądź też inhibitor enzymu.

W ostatnich latach rozdział enzymów na skalę przemysłową prowadzony jest przy użyciu technik membranowych, do których należy ultrafiltracja. Przepuszczając oczyszczany roztwór przez membranę o zdefiniowanej porowatości można uzyskać zagęszczony enzym, nieposiadający zanieczyszczeń w postaci soli czy niskocząsteczkowych związków. Frakcjonowanie odbywa się tu na zasadzie różnicy w rozmiarach cząsteczek, co ma odniesienie do ich masy cząsteczkowej.