2808184947

Biofizyka, wykład fi

NMR - określanie konformacji w roztworze

krystalografia rentgenowska - określanie struktury w stanie krystalicznym; główna zaleta: metoda najlepsza dla białek, rozwiązano nią 80% struktur białkowych, daje się stosować dla dużych układów molekularnych, większych niż NMR

NMR - można stosować NMR w ciele stałym, ale aktualnie zwykle stosuje się NMR w roztworach wodnych, trudniej niż przy krystalografii rozwiązać złożone układy molekularne, dobre dla niekrystalizujących substancji

Woda nieustrukturalizowana stanowi często nawet 50% kryształu molekularnego białek. Są rozbieżności struktur krystalicznych uzyskanych w krysztale w rentgenografii i tych samych białek w roztworze techniką NMR Na 70 białek około 18 wykazuje odstępstwa strukturalne między wyznaczonymi strukturami za pomocą tych dwu technik (Proteins 60, 134, 2005)

Struktura kwadrupłeksu DNA uzyskana została metodą krystalografii

granicą w krystalografii - cały rybosom bakteryjny wykrystalizowany (2,5 MDa)

granica w NMR - można uzyskiwać widma i je analizować nawet dla układów chaperoninów

GroEL i GroES, około 1 MDa

Dużego znaczenia nabrały metody, które nie mają rozdzielczości atomowych, ale analizują całe układy, są to techniki mikroskopowe (struktura przestrzenna jest uzyskiwana od razu). Można zejść niżej dzięki odpowiednim przekształceniom komputerowym.

Granica rozdzielczości mikroskopów optycznych - 200 nm, bo w mikroskopie wykorzystuje się optykę geometryczną, która nie zakłada falowej natury światła. Dochodzi się do granicy 200 nm (czyli mniej niż długość światła widzialnego), dlatego że stosuje się triki techniczne.

SNOM — mikroskopia bliskiego pola - rozdzielczość do 50 nm

jedna z technik mikroskopii elektronowej - cryoEM

wykorzystuje się falową własność elektronów, których długość fali zależy odwrotnie proporcjonalnie od prędkości. Im szybciej się poruszają elektrony, tym mniejszą mają długość fali i granica dyfrakcyjna przejawia się dużo niżej. Długości fali rzędów angsztremów nawet, ale występują aberracje (soczewki magnetyczne) i trudności techniczne sprawiają, że rozdzielczość sięga tylko 1 nm (10 A). Jest to 2-3 rzędy gorzej niż NMR czy krystalografia. CryoEM daje obrazy molekuł i kompleksów molekularnych,

Inna technika — AMF (mikroskopia sił atomowych) - schodzi do dziesiątych części nanometra. Działa na zupełnie innej zasadzie niż mikroskopia optyczna czy elektronowa. Nie chodzi o falową naturę cząstek. W AMF badaną cząsteczkę czy kompleks umieszczamy na odpowiednim podłożu (często mika), a potem skanujemy ostro zakończonym rylcem (musi mieć jak najmniejsze ostrze). Rylec jest utrzymywany w stałej odległości od skanowanej powierzchni, bo między rylcem a powierzchnią występują siły van der Waalsa - siły rzędu pN (pikonjutonów, 10-12 N) Utrzymanie stałej odległości umożliwia układ kompensacyjny, laser rejestruje jak porusza się rylec, który zakreśla powierzchnię badanej cząsteczki.