6827068733

Analiza restrykcyjna - metoda polegająca na specyficznym rozcinaniu, za pomocą enzymów restrykcyjnych (endonukleaz restrykcyjnych), (każda endonukleaza jest specyficzna i rozcina podwójna helise w specuficznym miejscu) długich cząsteczek DNA na fragmenty nadające się do różnego rodzaju manipulacji; a.r. umożliwia badanie struktury chromosomów, sekwencjonowanie bardzo długich cząsteczek DNA, izolowanie genów i tworzenie nowych cząsteczek DNA nadających się do klonowania; fragmenty DNA po rozdziale elektroforetycznym dają obraz charakterystyczny dla konkretnej cząsteczki DNA. Dzięki tej metodzie można ocenie efekty klonowania molekularnego.

Elektroforeza - technika analityczna stosowana w biologii molekularnej, której celem jest rozdzielenie mieszaniny fragmentów DNA o rożnej długości. Fragmenty DNA pod wpływem przepływającego prądu przemieszczają sie od ujemnie naładowanej anody do dodatniio naładowanej katody. W zależności od czynników (bedzie niżej jakich) fragmenty przesuwają sie szybciej lub wolniej. Próbki badanego DNA umieszcza sie w odciśniętych w żelu kieszonkach (zrobionych za pomocą grzebienia). Aby próbka była widoczna barwi sie ją najczęściej bromkiem etydyny lub Simplysafe. Prążki DNA pod światłem UV widoczne są jako pomarańczowe kreski.

Żel agarozowy -W żelach agarozowych można rozdzielić fragmenty od 200pz do 50000pz. ale ich zdolność rozdzielcza iest niższa. Próbka rozpuszczona jest z reguły w roztworze o większej gęstości (na przykład w formamidzie), dzięki czemu rozpływa się na dnie studzienki, a po włączeniu zasilania migruje do żelu jako wąski prążek. W zależności od techniki, cały żel lub jego końce zanurzone są w przewodzącym prąd roztworze buforowym. Wzdłuż krawędzi żelu, zwykle na dwóch przeciwległych bokach płytki, biegną elektrody

Żel poliakrylamidylowy - Elektroforezę w żelu poliakrylamidowym do rozdziału kwasów nukleotydowych stosuje się, kiedy potrzebna jest duża rozdzielczość. Żele agarozowe mają większe pory i rozdział cząsteczek o wielkości poniżej 1500 pz staje się mniej dokładny . Żele poliakrylamidowe stosuje się np. podczas sekwencjonowania DNA metodą terminacji łańcucha, wtedy gdy rozdzielane cząsteczki kwasów nukleinowych różnią się między sobą o pojedyncze nukleotydy^

Żele poliakrylamidowe sa najbardziej efektywne, rozdzielają cząsteczki DNA o wielkości od 5 do 500 pz. a w pewnych warunkach można rozdzielić fragmenty DNA różniące sie jednym nukleotydem. Można również rozdzielić dwa łańcuchy DNA o takiej samei długości ieśli różnią sie one sekwencja nukleotydów

Czynniki wypływające na szybkosc migracji DNA w żelu :

1.    Wielkość cząsteczki

mniejsze fragmenty wędrują szybciej

2.    konformacja DNA

3 formy konformacyjne plazmidowego DNA, superspiralna kolista (CCC), otwarta kolista (OC) i liniowa (L) wędrują przez żel z różną szybkością. Zwykle najszybciej wędruje forma CCC, następnie forma L, a najwolniej forma OC.

3.    koncentracja agarozy/akrylamidu

-wzrost stężenia żelu obniża szybkość migracji -wzrost stężenia żelu wpływa również na zakres rozdziału cząsteczek DNA

4.    wartość przyłożonego napięcia

Przy niskich napięciach szybkość migracji jest proporcjonalna do przyłożonego napięcia. Jeśli napięcie wzrasta to szybkość migracji cząstek DNA wzrasta w zależności od wielkości. Najlepsze rozdziały elektoforetyczne są otrzymywane przy zastosowaniu prądu ok. 5V/cm odległości pomiędzy elektroda

5.    skład nukleotydowy i temperatura

6.    obecność barwników interkalacyjnych

7.    skład buforu do elektroforezy (siła jonowa)