��Metody badania polimorfizmu DNA Metody badania polimorfizmu DNA dr Aleksandra SaB
agacka Pracownia Biologii Molekularnej i Farmakogenomiki Uniwersytet Medyczny w A
odzi Metody wykrywania mutacji Metody wykrywania mutacji niezdefiniowanych niezdefiniowanych PCR-SSCP PCR-SSCP " Single strand conformation polymorphism  polimorfizm konformacji fragment�w jednoniciowych " ssDNA przyjmuje w warunkach niedenaturuj
cych unikaln
struktur
drugo- i trzeciorz
dow
" konformacja ta jest zale|
na od sekwencji nukleotydowej " r�|
ne konformery r�|
ni
si
ruchliwo[
ci
elektroforetyczna " pojedyncze r�|
nice w sekwencji, wywoB
ane mutacj
punktow
powoduj
zr�|
nicowan
migracj
i charakterystyczne poB
o|
enie w |
elu poliakrylamidowym. PCR-SSCP  etapy: PCR-SSCP  etapy: 1) reakcja PCR  powielenie badanego fragmentu DNA 1) denaturacja dsDNA (silna zasada, formamid, wysoka temp.) - powstaj
ssDNA 1) elektroforeza |
elowa ssDNA w warunkach niedenaturuj
cych 1) wykrywanie konformer�w pojedynczych nici w |
elu (np. wybarwienie bromkiem etydyny) PCR-SSCP PCR-SSCP AA AB BB AA BB AB AA BB BB BB BB BB BB PCR-HDA PCR-HDA " Heteroduplex analysis - analiza heterodupleks�w " ssDNA, powstaB
e w procesie denaturacji dsDNA, podczas powolnej renaturacji B
acz
si
przypadkowo w struktury dwuniciowe, tzw. dupleksy " mo|
liwe jest B

czenie si
nici w peB
ni do siebie komplementarnych (homodupleksy), jak i nie (hereodupleksy)  homozygoty  homodupleksy  heterozygoty  hetero- i homodupleksy PCR-HDA PCR-HDA Heterodupleksy posiadaj
mniejsz
ruchliwo[

elektroforetyczn
(rozluz
nienie struktury w miejscu niepeB
nego sparowania) ni|
homodupleksy. HDA  etapy: HDA  etapy: 1) reakcja PCR  powielenie badanego fragmentu DNA 1) denaturacja dsDNA (wysoka temp.)  powstaj
ssDNA 1) renaturacja ssDNA  B

czenie ssDNA w homo- i/lub heterodupleksy 1) elektroforeza dupleks�w w |
elu poliakrylamidowym 1) wykrywanie dupleks�w w |
elu (np. wybarwienie bromkiem etydyny) PCR-HDA PCR-HDA PCR-CMC PCR-CMC " Chemical mismatch cleavage  chemiczne rozszczepianie niesparowanych heterodupleks�w " podobnie jak HDA wykorzystuje zjawisko powstawania heterodupleks�w " niesparowane zasady w heterodupleksach poddaje si
modyfikacji chemicznej (cytozyna  hydroksylamina, tymina  czterotlenek osmu) " zmodyfikowane cz
steczki DNA ulegaj
przeci
ciu pod wpB
ywem piperydyny �! zmiany w obrazie elektroforetycznym PCR-DGGE PCR-DGGE " Denaturing Gradient Gel Electrophoresis - elektroforeza w |
elu z gradientem czynnika denaturuj
cego " dsDNA ulega denaturacji przy r�|
nych st
|
eniach zwi
zk�w denaturuj
cych w zale|
no[
ci od skB
adu zasad i sekwencji nukleotydowej  zw. denaturujace: formamid, mocznik, chlorowodorek guanidyny " produkty PCR o r�|
nej sekwencji b
d
w ro|
nych miejscach |
elu ulega
denaturacji �! zmiany w obrazie elektroforetycznym " je[
li czynnikiem denaturuj
cym jest temperatura  PCR-TGGE PCR-DGGE PCR-DGGE PCR-DGGE PCR-DGGE Metody wykrywania mutacji Metody wykrywania mutacji zdefiniowanych zdefiniowanych PCR-RFLP PCR-RFLP Restriction Fragment Length Polymorphism polimorfizm dB
ugo[
ci fragment�w restrykcyjnych Enzymy restrykcyjne (restryktazy, endonukleazy) �� enzymy bakteryjne �� naturalny mechanizm obronny bakterii  ochrona przed wirusowym DNA (system restrykcji  modyfikacji) �� posiadaj
zdolno[

do rozpoznawania kr�tkich 4-8- nukleotydowych sekwencji DNA i ich przecinania PCR-RFLP PCR-RFLP " Restriction Fragment Length Polymorphism  polimorfizm dB
ugo[
ci fragment�w restrykcyjnych " mutacja powoduje powstanie lub zanik miejsca rozpoznawanego przez okre[
lony enzym restrykcyjny �! zmiana w obrazie elektroforetycznym po trawieniu e. restrykcyjnym (zmiana liczby i dB
ugo[
ci fragment�w DNA) PCR-RFLP  etapy: PCR-RFLP  etapy: 1) reakcja PCR  powielenie badanego fragmentu DNA 1) trawienie produktu PCR enzymem restrykcyjnym 1) elektroforeza produktu reakcji trawienia 1) ocena wzoru pr
|
kowego PCR-RFLP PCR-RFLP 206 par zasad 130 par zasad 76 par zasad [
cie|
ki 1,2,5 - heterozygota CT [
cie|
ka 3 - homozygota CC [
cie|
ka 4 - homozygota TT Allele Specific PCR (AS-PCR) Allele Specific PCR (AS-PCR) " dwie r�wnolegB
e reakcje PCR dla tej samej pr�by badanej " jeden starter wsp�lny dla obu reakcji " drugi starter swoisty dla sekwencji zmutowanej lub niezmutowanej  komplementarny do sekwencji, w kt�rej mo|
liwa jest zmiana mutacyjna " ocena mutacji  obecno[

/braku produktu w obydwu reakcjach PCR PCR-ASO PCR-ASO " Allele specific oligonucleotide  hybrydyzacja z allelowo-specyficznymi sondami oligonukleotydowymi " sondy  znakowane oligonukleotydy (fluorescencyjnie, izotopowo) " dwie sondy - jedna komplementarna do allela dzikiego, druga do allela zmutowanego PCR-ASO  etapy: 1) reakcja PCR  powielenie badanego fragmentu DNA 1) naniesienie produktu PCR na membrany nylonowe 1) naniesienie sond na membrany 1) hybrydyzacja sondy-produkt PCR 1) detekcja sygnaB
�w do shybrydyzowanych sond  ocena genotypu Analiza mutacji za pomoc
Analiza mutacji za pomoc
techniki real-time PCR techniki real-time PCR RT-PCR  zasada metody RT-PCR  zasada metody " polega na monitorowaniu przyrostu ilo[
ci DNA w czasie reakcji amplifikacji " ilo[

kopii DNA mierzona jest  po ka|
dym cyklu reakcji amplifikacji  poprzez pomiar fluorescencji, kt�ra pochodzi od barwnik�w fluorescencyjnych wi
|

cych si
z powielanym DNA " intensywno[

sygnaB
u jest proporcjonalna do ilo[
ci DNA w mieszaninie Analiza mutacji Analiza mutacji Analiza Analiza Sondy Sondy krzywych krzywych swoiste swoiste topnienia topnienia dla sekwencji dla sekwencji Sondy swoiste dla sekwencji Sondy swoiste dla sekwencji " dwie sondy swoiste dla sekwencji: dzikiej, zmutowanej " wyznakowane dwoma r�|
nymi fluoroforami " genotyp okre[
lany na podstawie obeno[
ci/braku sygnaB
u pochodz
cego od obydwu sond + + - allel dziki - + + allel zmutowany homozygota heterozygota homozygota zmutowana dzika Analiza krzywych topnienienia Analiza krzywych topnienienia Etapy:  amplifikacja badanego fragmentu DNA  inkubacja w celu tworzenia heterodupleks�w  precyzyjna denaturacja �! wykre[
lenie krzywych topnienia  por�wnanie ksztaB
t�w krzywych denaturacji i precyzyjne wyznaczenie temperatury topnienia Homozygota dzika vs homozygota zmutowana  r�|
ne warto[
ci Tm Homozygoty vs heterozygota  ksztaB
t krzywych denaturacji Sekwencjonowanie Sekwencjonowanie sekwencja DNA  kolejno[

i rodzaj nukleotyd�w w nici DNA Sekwencjonowanie - peB
na informacja o sekwencji DNA