3685665863

WYKŁADY

nego punktu widzenie byłby pomiar końcowych produktów glikacji a nie

z pewnością będzie milowym krokiem w zrozumieniu procesu nieenzy-matycznej glikacji i pozwoli na wprowadzanie nowych terapii znanych chorób.

WYKŁADY NA SESJACH NAUKOWYCH I. NOWE TECHNOLOGIE I PRZYKŁADY ICH ZASTOSOWANIA

Mikromacierze, nanotechnologia, lab on a chip.

Urszula Demkow

Mikromacierze (microarray) to miniaturowe układy hybrydyzacyjne składające się z różnego typu sond rozpoznających fragmenty genów, trans-kryptów lub białek. Poziom ekspresji badanych genów, transkryptów lub obecność protein ocenia się mierząc natężenie emitowanej punktowo fluorescencji. Pomiaru dokonuje się za pomocą odpowiedniego analizatora. Mikromacierze mogą one służyć zarówno do analizy strukturalnej jak i czynnościowej genomu, transkryptomu lub proteomu. Mikromacierze znajdują coraz szersze zastosowanie w wielu dziedzinach biologii i medycyny, w tym w rutynowej diagnostyce. Zaletą techniki mikromacie-rzy w diagnostyce jest znaczne przyspieszenie procesu analitycznego, synchronizacja wielu oznaczeń w jednym czasie oraz niewielka ilość niezbędnego do analizy materiału. Mikromacierze są przydatnym narzędziem do badań genomu. Stwarzają możliwości poznania sekwencji materiału genetycznego, mapowania genomu oraz określenie zależności wewnątrz genomu. Mikromacierze mają potencjalnie bardzo szerokie znaczenie w onkologii. t/tfcorce ekspresji genów umożliwiają bardziej precyzyjną stratyfikację chorych. Analiza proteomu komórki może mieć również duże znaczenia diagnostyczne i poznawcze. Mikromacierze mogą służyć jako metoda badawcza ułatwiająca identyfikację istotnego punktu uchwytu dla leku hamującego wzrost guza. Badania można prowadzić in vilro na wyizolowanych od chorego komórkach nowotworowych. Farmakogenomika nowotworów pozwala na odkrycie nowych leków przeciwnowotworowych oraz molekularnych celów dla nich na podstawie poznania mechanizmu onkogenezy. Technika mikromacierzy stała się jednym z ważniejszych narzędzi farmakogenomiki. Nanotechnologia zajmuje się obiektami o rozmiarach w granicach od 1 do 100 nanometrów. Rozwój nanotechnologii możliwy był dzięki rozwojowi skaningowej mikroskopii tunelowej, pozwalającej oglądać obiekty wielkości atomów. Obiekt zbudowany z tych samych atomów w skali makroskopowej ma zupełnie inne, obserwowane w naszym codziennym życiu właściwości. Przy rozdrobnieniu do wielkości cząstek rzędu nanometrów pojawiają się nowe cechy fizyczne. Wynikają one z dużego stosunku powierzchni cząstek w stosunku do zajmowanej przez nie objętości. Nanodiagnostyka polega na zastosowaniu urządzeń pracujących w na-noskali. Pozwalają one na znaczne zwiększenie czułości metody i przyspieszenie procesu analitycznego. Przykładem miniaturyzacji urządzeń pomiarowych może być laboratorium na szkiełku (lab -on a chip). Wykorzystując taką technologię kilkadziesiąt tysięcy reakcji biochemicznych dziennie można przeprowadzić za pomocą układu mikroprzepływowego wielkości karty kredytowej. Reakcje zachodzą we wnętrzach drobnych kropel, przesuwających się wzdłuż odpowiednio zaprojektowanych kanalików. Objętości kropel są kontrolowane za pomocą komputera. Przy małych objętościach przepływ jest laminamy co ułatwia kontrolowanie przebiegu reakcji. Układy wytwarzające kropelki są proste i tanie, substancje w mikrokanalikach doskonale się mieszają, a ich przepływ zazwyczaj jest wymuszany różnicą ciśnień. Pomimo ogromnych sukcesów nowych technologii znaczący postęp techniczny nie idzie jeszcze w parze z zastosowaniami klinicznymi. Stopień skomplikowania analiz, złożoność i koszt aparatury oraz trudności związane ze złożoną analizą biostatystyczną stanowią wciąż ogromne wyzwanie.

Możliwości aplikacyjne LC-MRM/MS do rutynowego oznaczenia stężenia białek i peptydów w osoczu, moczu oraz tkance Dominik Domański

W ciągu ostatnich dwudziestu lat biochemia białek została zrewolucjonizowana dzięki rozwojowi nowych technologii spektrometrii mas tworząc dziedzinę zwaną proleomiką. Badania proteomów różnych organizmów za pomocą spektrometrii mas pozwoliły na identyfikację i pomiar stężenia tysięcy białek, badanie ich posttranslacyjnych modyfikacji oraz analizę ich struktury. Globalne analizy proteomiczne doprowadziły do identyfikacji potencjalnych biomarkerów wielu chorób, w tym markerów chorób nowotworowych, chociaż większość z nich czeka na walidacje za pomocą bardziej specyficznych metod. Przed kilku laty w proteomice powstał nowy sposób analizowania prób, zwany analizą ukierunkowaną- Multiple Reaction Monitoring (MRM). Zastosowanie tej analizy spowodowało znaczny wzrost liczby prowadzonych badań proteomicznych m.in. dotyczących walidacji biomarkerów, dzięki możliwości dokładnego pomiaru ilościowego konkretnych białek w bardzo zróżnicowanym materiale biologicznym organizmów (począwszy od roślin po płyny ustrojowe człowieka). Do zalet metody MRM należy krótki czas analizy (poniżej jednej godziny) oraz jej wysoka wydajność. Co więcej, dzięki możliwości użycia syntetycznych peptydów wyznakowanych ciężkimi aminokwasami i nowoczesnych spektrometrów mas, analiza MRM pozwala na pomiar białek ze specyficznością, precyzją, powtarzalnością oraz czułością nieosiągalną dla innych metod analitycznych w biochemii. Aplikacje tej innowacyjnej, ilościowej techniki proteomicznej zostaną przedstawione w oparciu o przykłady oznaczeń stężenia białek i peptydów w osoczu, moczu oraz tkance w badaniach naukowych z potencjalnymi możliwościami zastosowań w rutynowych laboratoriach diagnostycznych w przyszłości.

Ilościowe oznaczenia za pomocą LC-MS/MS w materiale klinicznym panelu leków immunosupresyjnych Leszek Pączek

Streszczenia nie dostarczono

Możliwości zastosowania HPLC i LC-MS/MS w rutynowym oznaczaniu metabolitów witaminy D oraz paneli hormonów sterydowych Zbigniew Bartoszewicz

W rutynowej diagnostyce medycznej stężenia metabolitów witaminy D oraz hormonów sterydowych są najczęściej oznaczane za pomocą testów immunochemicznych. Używane w testach przeciwciała wykazują różne powinowactwo w stosunku do poszczególnych Izoform mierzonego analitu oraz mogą reagować krzyżowo z innymi związkami znajdującymi się w badanym materiale biologicznym, co wpływa na wiarygodność otrzymywanych wyników. Z pośród wielu metabolitów witaminy D najczęściej oznaczane jest stężenie jej 25-hydroksylowanej formy (250HD, kalcidiol), która najlepiej odzwierciedla status witaminy D w organizmie. W surowicy dominującą jest izoforma 250HD_S (cholekal-cidiol), jakkolwiek w zależności od rodzaju stosowanej diety, trybu życia i rodzaju suplementacji izoforma 2SOHD, (ergokaIcidiol) może stanowić znaczny udział. Dodatkowo u niemowląt występuje forma epimeryczna C-3a-hydroxy epimer -250HD. Przeciwciała w testach immunochemicznych w różnym stopniu rozpoznają 250HD₃, 250HD_Z i C-3 epimer, reagują krzyżowo z formami laktonowy-mi oraz innymi metabolitami np. z 24,25-dihydroksy witaminą D. Z tego powodu wyniki pomiaru stężenia 250HD wykonane testami immunochemicznymi różnych producentów mogą znacznie od siebie odbiegać co obserwuje się w międzynarodowym programie kontroli jakości (Vitamin D External Quality Assessment Scheme -DEOAS). W konsekwencji znaczące dysproporcje w wynikach stężeń 25(OH)D mogą mieć wpływ na podejmowanie odmiennych decyzji dotyczących leczenia danego pacjenta. Powyższych problemów można uniknąć stosując do pomiarów stężeń wysokosprawną chromatografię cieczową sprzężona z tandemowym spektrometrem mas (LC-MS/MS). Obecnie stosowane kolumny chromatograficzne pozwalają na rozdział 250HD_S, 250HD₂ i C-3 epimeru, a po ich zjonizowaniu w trybie monitorowania wybranych reakcji MRM - Mulli Reaction Monitońng w spektrometrii mas poddaniu analizie powstałych z jonów macierzystych charakterystycznych dla danego analitu jonów fragmentacyjnych (potomnych). Wyniki pomiaru stężenia 250HD metodą LC-MS/MS w programie DEOAS wykazują wyższą wiarygodność w porównaniu z metodami immunochemicznymi. Dodatkowo w badanej próbce można określić udział poszczególnych izoform 250HD₃,250HD₂ oraz C-3 epimeru. Diagnostyka wielu ważnych chorób układu endokrynnego bazuje na oznaczeniach stężeń