1588094225

Rys 4. Schemat budowy wektora plazmidowego i działania markerów selekcyjnych.

2.3.3.    Wektory bifunkcjonalne

Wektory bifunkcjonalne to wektory, które zawierają elementy umożliwiające ich powielanie i selekcję w komórkach dwóch gospodarzy, np. E. coli i drożdży Saccharomyces cerevisiae. Większość wektorów bifunkcjonalnych zawiera elementy plazmidu bakteryjnego (Ori, markery, patrz wyżej) oraz początek replikacji i markery selekcyjne specyficzne dla drugiego gospodarza. Obecność sekwencji E. coli ułatwia izolację i manipulacje DNA (np. konstrukcję banku genów), a sekwencje drugiego gospodarza umożliwiają transformację drugiego gospodarza, np. w celu selekcji genów z banku poprzez komplementację mutacji lub badania funkcji genu.

W przypadku drożdży Ori pochodzi albo z chromosomu drożdżowego (ARS) albo z plazmidu drożdżowego 2\x. Markerami są najczęściej geny kodujące enzymy ze szlaku biosyntezy aminokwasów lub nukleotydów, które można zastosować do transformacji odpowiednich mutantów pokarmowych S. cerevisiae (np. geny LEU, TRP, HIS, URA). Wektory z sekwencjami 2p występują w komórkach drożdży w wielu kopiach. Jeżeli chcemy wprowadzić do komórek tylko jedną kopię genu, możemy użyć plazmidu, który zawiera dodatkowo sekwencje centromerowe (CEN).

Skonstruowano również wektory w oparciu o sekwencje chromosomowe drożdży (ARS, CEN, telomery), które umożliwiają klonowanie bardzo dużych fragmentów DNA. Są to tzw. YAC (od ang. yeast artificial chromosomes), które okazały się bardzo przydatne do badania genomów wyższych eukariontów, między innymi człowieka.

2.3.4.    Wektory ekspresyjne

Wektory ekspresyjne umożliwiają ekspresję wstawionej do nich sekwencji DNA kodującej białko. Wektory bakteryjne, które służą do otrzymywania białka eukariotycznego muszą posiadać dodatkowe elementy takie jak:

Sekwencja promotorowa - silny promotor umiejscowiony przed miejscem wprowadzenia sekwencji kodującej. Może być konstytutywny albo regulowany.

Sekwencja Shine-Dalgarno (SD=RBS) - miejsce wiązania rybosomów bakteryjnych. Sekwencja ATG może pochodzić ze wstawki albo również znajdować się na wektorze. Terminator transkrypcji - za sekwencją kodującą.