1588094227

Aby ocenić czy bank reprezentuje cały genom trzeba znać:

1)    wielkość genomu badanego organizmu;

2)    liczbę transformantów uzyskanych po transformacji bakterii mieszaniną ligacyjną;

3)    udział transformantów niosących zrekombinowane plazmidy (zwykle określa się to w oparciu o dodatkowy marker na wektorze, w obrębie którego wstawia się klonowane fragmenty DNA, np. fragment p-gal, patrz wyżej);

4)    średnią wielkość wstawki (np. poprzez ocenę wielkości próbki zrekombinowanych plazmidów wyizolowanych z transformantów).

Liczbę klonów wymaganych, aby każdy gen był reprezentowany w bibliotece z prawdopodobieństwem 0,99 można określić według wzoru: lntl-Pł N= ln(l-f)

N = liczba klonów

P = pożądane prawdopodobieństwo (0,99) f = średnia wielkość wstawki/wielkość genomu

Dobry bank genów w E. coli na wektorze plazmidowym zwykle zawiera ponad 50% zrekombinowanych plazmidów ze średnią wielkością wstawki ok. 10 kb i pokrywa kilkakrotnie genom organizmu dawcy. Większe fragmenty (mniejsza liczba klonów wymagana dla pokrycia genomu) można klonować przy zastosowaniu specjalnych wektorów np. kosmidów, które łączą właściwości bakteriofagów i plazmidów oraz BAC (sztucznych chromosomów bakteryjnych, pochodnych plazmidu płciowego F).

2.5. IZOLOWANIE I BADANIE GENÓW WŻSZYCH EUKARYOTA

Poniżej przedstawiono schemat różnych strategii klonowania genów wyższych Eukaryota