274845132

Ćwiczenie 1

Oznaczenia enzymatyczne w diagnostyce medycznej Oznaczanie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika

Aminotransferaza alaninowa (AlaT; transaminaza glutaminian:pirogronian = GPT; EC 2.6.1.2) oraz aminotransferaza asparaginianowa (AspT; transaminaza glutaminian:szczawiooctan = GOT; EC 2.6.1.1) są enzymami uczestniczącymi w metabolizmie aminokwasów. Szczególnie dużą aktywnością tych enzymów charakteryzują się: wątroba, serce, mózg i mięśnie szkieletowe. U zdrowego człowieka aktywność aminotransferaz w osoczu jest znikoma, a jej wzrost niemal zawsze wskazuje na uszkodzenie któregoś z wymienionych narządów. Wysoką aktywność aminotransferaz stwierdza się m.in. u chorych z zawałem serca (głównie AspT), wirusowym zapaleniem wątroby (głównie AlaT), marskością lub nowotworem wątroby oraz dystrofią mięśniową. Pomiar aktywności aminotransferaz w osoczu jest zatem rutynowo wykorzystywany w diagnostyce medycznej. W warunkach normy aktywność aminotransferaz powinna zawierać się w granicach 8-38 jednostek l"¹ surowicy krwi.

Zasada pomiaru aktywności aminotransferaz

Aminotransferaza alaninowa (AlaT) katalizuje reakcję:

L-Alanina + 2-OksogIutaran <-> Pirogronian + L-Glutaminian (1)

Aktywność enzymu jest określana szybkością przyrostu stężenia produktu reakcji - pirogronianu. Zawartość tego związku można oznaczyć spektrofotometrycznie przy długości fali 340 nm na podstawie spadku stężenia NADH, który jest zużywany podczas katalizowanego przez dehydrogenazę mleczanową przekształcenia pirogronianu w mleczan:

Pirogronian + NADH Mleczan + NAD⁺ (2)

Obie reakcje są prowadzone równolegle w tej samej kuwecie, co pozwala na bieżąco śledzić szybkość reakcji katalizowanej przez aminotransferazę alaninową.

Aktywność aminotransferazy asparaginianowej (AspT) jest oznaczana w analogiczny sposób. Enzym ten katalizuje reakcję:

L-Asparaginian + 2-Oksoglutaran <-> Szczawiooctan + L-Glutaminian (1)

Stężenie produktu tej reakcji - szczawiooctanu można mierzyć spektrofotometrycznie przy długości fali 340 nm na podstawie spadku stężenia NADH w reakcji katalizowanej przez dehydrogenazę jabłczanową:

Szczawiooctan + NADH Jabłczan + NAD⁺ (2)

Celem ćwiczenia jest oznaczenie aktywności aminotransferaz w surowicy krwi królika.