DSC00276 2

ĆWICZENIE 4. Oznaczanie aktywności ceruloplazmlny metodą Ravlna.

Ceruloplazmina (Cp) jest miedzioproteiną wykazującą aktywność oksydoreduktazy żelazo (II): 0₂. Enzym ten katalizuje przenoszenie 4 elektronów na cząsteczkę 0₂, przy czym powstaje bezpośrednio cząsteczka H₂0. Cp jest główną oksydazą występującą w osoczu krwi i jej fizjologicznymi substratami w organizmie są adrenalina, noradrenalina, dihydroksyfenyloalanina j kwas askorbinowy. Cp wykazuje aktywność ferrooksydazy, katalizującej utlenianie żelaza w organizmie.

Zasada:

Dobrym substratem dla ceruloplazminy jest p-fenylenodiamina (PPD). W pierwszym etapie reakcji powstaje kompleks enzym-substrat dzięki połączeniu miedzi enzymu z elektonami tt pierścienia aromatycznego PPD. Następnie dochodzi do przeniesienia elektronów z substratu na enzym, przy czym Cu (II) zostaje zredukowana do Cu (I), a z PPD powstaje wolny rodnik. Cu (I) w Cp jest utleniana przez tlen, a rodnik powstały z PPD ulega dalszym przemianom, tworząc barwny fioletowy produkt, utworzony z 3 cząsteczek substratu (zasada Bandrowskiego).

Wykonanie:

1. Przygotuj 2 ponumerowane probówki i postępuj zgodnie z poniższą tabelą:

	próba badana	próba kontrolna
% I	dodaj po 4 ml_ buforu octanowego o pH 5,5
| 2. ;	preinkubuj przez 15 min. w łaźni wodnej o temp. 37°C
\ 3. |		dodaj 0,5 mL 0,5% azydku sodu (NaN2)
i 4.	dodaj po 50 pL surowicy
I — 5.	dodaj po 0,5 mL 0,5% roztworu PPD, dokładnie wymieszaj
I 6.	inkubuj przez 60 min. w łaźni wodnej o temp. 37°C
t 7.	dodaj 0,5 mL 0,5% azydku sodu, dokładnie wymieszaj	1 1

2.    Zmierz absorbancję próby badanej przy długości fali A = 530 nm względem próby kontrolnej

(próba ślepa).

3.    Oblicz aktywność ceruloplazminy według wzoru:

Cp [U/L] * Asjonm *2644

2g44 - współczynnik kalibracji, uwzględniający objętość mieszaniny inkubacyjnej, molowy współczynnik absorbancji i przeliczenie jednostek na wymagane w międzynarodowej jednostce enzymatycznej